基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的葛花治療酒精性肝損傷的作用機制探討

黃秋連，謝璐欣，葛 菲 ，楊碧穗，吳 波，朱玉野，吳志瑰，李袁杰，申本華，蔣 成，鄧可眾

（江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004）

【研究意義】酒精性肝損傷（alcoholic liver disease，ALD）是指長期過度飲酒而導(dǎo)致的肝臟疾病，嚴(yán)重會導(dǎo)致人體肝功能衰竭而死亡[1-4]， 發(fā)病機制復(fù)雜， 主要與氧化應(yīng)激反應(yīng)、 炎癥反應(yīng)、 乙醇代謝反應(yīng)、脂代謝等有關(guān)[5]。隨著社會快速發(fā)展，ALD 是危害人民健康的常見疾病，據(jù)相關(guān)統(tǒng)計，每年全世界 40% 肝硬化死亡患者中是由 ALD 導(dǎo)致[6]。目前臨床西醫(yī)治療手段主要以戒酒和營養(yǎng)支持為主，還未研制出特別理想的治療藥物，而現(xiàn)代臨床研究表明中藥治療 ALD 具有高效、低毒等優(yōu)勢，因此挖掘傳統(tǒng)中藥預(yù)防和治療 ALD 及其作用機制非常迫切[7-12]。 葛花 （Puerariae fos） ， 豆科植物葛(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi) 或粉葛(Pueraria thomsoniiBenth)的干燥花，始載于《名醫(yī)別錄》，具有解酒醒脾的作用，是最具代表性的解酒藥物之一[13-14]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)分析葛花治療 ALD 的成分和潛在作用機制，為今后開展葛花治療 ALD 的研究提供進一步的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

【前人研究進展】現(xiàn)代藥理研究表明，葛花對于治療酒精性肝損傷具有顯著療效，但是葛花發(fā)揮療效的成分和作用機制目前尚未完全清楚[15]。雷紅偉等[16]研究發(fā)現(xiàn)，葛花粗提物與葛花總異黃酮提取物對酒精性肝損傷均有良好的治療作用。朱雷蕾等[17]研究表明，葛花水煎液對酒精性肝損傷有治療作用。張國哲等[18]研究表明，葛花水提物解酒效果強于葛花總黃酮提取物。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)進行中藥分子作用機制研究已有大量文獻報道，并且成為一個熱門的研究策略，該技術(shù)通過多網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)分析平臺構(gòu)建“藥物-靶點-疾病-信號通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)分析的研究模式，可以更直觀、更全面的具體闡述中藥多成分、多靶點的分子作用機制[19]。

【本研究切入點】本研究運用現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究技術(shù)，通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)分析平臺，直觀、全面的闡述葛花治療酒精性肝損傷的分子作用機制。

【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過多個數(shù)據(jù)挖掘、分析平臺擬篩選出葛花治療 ALD 的有效活性成分以及關(guān)鍵作用靶點，并通過對關(guān)鍵靶點的 GO 富集分析與 KEGG 通路注釋分析，預(yù)測葛花治療 ALD 的關(guān)鍵通路，為研究葛花治療 ALD 提供理論和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 有效成分篩選及靶點預(yù)測

以“葛花”為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%與類藥性（drug likeness， DL）≥0.18 為條件通過 TCMSP（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺，http://tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索并篩選出候選化合物及其潛在作用靶點，空缺成分的潛在作用靶點利用 Swiss Target Predicition （http://new.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫進行補充；在 UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中限定物種為“human”，進行靶點信息比對和基因名校正。

1.2 相關(guān)靶點篩選

以“Alcoholic Liver Disease”為檢索詞，運用 DisGeNET（http://www.disgenet.org/）、DrugBank （https://www.drugbank.ca/）、OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫檢索得到疾病的相關(guān)作用靶點。對 3 個數(shù)據(jù)庫疾病靶點進行合并和去除重復(fù)值，通過 UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）校正其蛋白名稱為官方名稱，并限定物種來源為人。

1.3 成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過 Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將篩選出的有效成分潛在作用靶點與疾病相關(guān)靶點取交集，以獲得葛花治療酒精性肝損傷的潛在作用靶點。再運用 Cytoscape3.7.2 構(gòu)建“化合物- 作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，以化合物與靶點之間的連接情況為條件，篩選出葛花作用于 ALD 的關(guān)鍵化合物。

1.4 共同靶點蛋白互作（PPI）的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選

為研究葛花治療 ALD 的靶蛋白之間的相互作用關(guān)系，將“藥物-疾病”的交集靶點基因?qū)?String(http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為 Homo sapiens，獲取靶點的相互作用關(guān)系，并導(dǎo)入 Cytoscape3.7.2 軟件中，以網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的拓?fù)涮卣鳛闂l件，分析并篩選關(guān)鍵作用靶點。將關(guān)鍵作用靶點運用 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫獲取類型信息，得到葛花防治 ALD 作用關(guān)鍵靶點的信息。

1.5 GO 分析和 KEGG 通路富集分析

將共有靶點導(dǎo)入 DAVID Bioinformatics Resources 6.7（https://david-d.ncifcrf.gov/summary.jsp）進行 GO 富集分析和 KEGG 富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 葛花有效成分篩選及靶點獲取

在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索到葛花化合物 138 個，并根據(jù) OB≥30%和 DL≥0.18 篩選出葛花有效成分 18 個，各個化合物及其 OB 和 DL 值見表 1。通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫查找到 17 個有效成分的靶點，刪除重復(fù)靶點后共 199 個預(yù)測靶點。 葛花苷 （Kakkalide） 在 TCMSP 未找到作用靶點， 通過 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫補充并篩選排名前 15 的靶點。兩個數(shù)據(jù)庫刪除重復(fù)值后共得到葛花有效成分的預(yù)測靶點 208 個。

表 1 葛花有效成分

2.2 疾病靶點預(yù)測結(jié)果

經(jīng)過檢索 DisGeNET、OMIM、DrugBank 3 個數(shù)據(jù)庫，分別篩選到 84、516 和 17 個靶點，去除重復(fù)靶點后獲到疾病靶點 610 個。

2.3 葛花治療酒精性肝損傷潛在作用靶點預(yù)測

將所得的有效成分相關(guān)靶點與疾病相關(guān)靶點運用 Venny2.1 （https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）取交集得到葛花治療 ALD 的作用靶點 31 個（圖 1），對應(yīng)葛花化合物 13 個，此交集靶點即為葛花治療 ALD 的潛在作用靶點，其中 5 個化合物不參與有效化合物-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。借助 Cytoscape3.7.2 繪制有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖 2），紅色六邊形表示有效化合物，黃色菱形表示葛花治療 ALD 的共有靶點，其中 Degree 值越大，節(jié)點越大。

圖 1 葛花與 ALD 的靶點韋恩圖

圖 2 有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)

圖 3 葛花治療 ALD 潛在作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 共同靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析

將 31 個共有靶點采用 string 平臺進行 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建的 PPI網(wǎng)絡(luò)包括 31 個節(jié)點，183 條相互作用連線；將數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape3.7.2 中，繪制共有靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，如圖 3，其中 Degree 值越大，表示節(jié)點越大、顏色越亮；Combined score 值越大，表示邊越粗。并借助 Cytoscape3.7.2 軟件對相互作用網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)浞治觯瑢⒆杂啥取⒔閿?shù)、中心度均大于中位數(shù)的靶點取交集，篩選出 12 個關(guān)鍵靶點，運用 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫， 得到蛋白歸屬信息， 這些靶點可能是葛花治療 ALD 的關(guān)鍵靶點， 見表 2。 結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點主要涉及信號分子 （signaling molecule）、 轉(zhuǎn)錄因子 （transcription factor）、 水解酶 （hydrolase）、氧化還原酶（oxidoreductase）、核酸結(jié)合（nucleic acid binding）、細胞骨架蛋白（cytoskeletal protein）。

表 2 葛花治療 ALD 關(guān)鍵靶點基本信息

圖 4 GO 富集分析

圖 5 KEGG 通路分析

2.5 共有靶點的 GO 富集分析與 KEGG 通路注釋分析

通過 DAVID 在線數(shù)據(jù)庫對葛花治療 ALD 的 31 個潛在作用靶點進行 GO 富集分析得到 222 個生物過程、15 個細胞組分以及 32 個分子功能富集結(jié)果，根據(jù)P＜0.01 確定了 95 個生物過程相關(guān)條目，主要涉及炎癥反應(yīng)、細胞對脂多糖的反應(yīng)、脂多糖誘導(dǎo)信號通路、RNA 聚合酶 II 啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程負(fù)調(diào)控、血管生成的正調(diào)控、PERK 介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)、細胞對有機環(huán)化合物的反應(yīng)、血管內(nèi)皮細胞遷移的陽性調(diào)節(jié)、基因表達的正調(diào)控等；3 個細胞組分相關(guān)條目，主要涉及細胞外隙、胞外區(qū)和胞器膜；19 個分子功能相關(guān)條目，主要涉及細胞因子活性、氧化還原酶活性、藥物結(jié)合、酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、芳香酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、鐵離子結(jié)合、氧結(jié)合等。各將排名前 10 的條目進行可視化條形圖繪制，如圖 4。KEGG 富集分析總獲得信號通路 48 條，依據(jù)P＜0.01 得到 29 條顯著信號通路，主要富集于 NOD 樣受體信號通路、細胞色素 P450 對外源性藥物代謝的影響、Toll 樣受體信號通路、TNF 信號通路、炎癥性腸病、FoxO 信號通路、MAPK 信號通路、HIF-1 信號通路等。選取P值排名前 20 的信號通路繪制氣泡圖，如圖 5。

3 討 論

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建葛花治療 ALD 的“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)以及 KEGG 富集分析，篩選得到葛花治療 ALD 的潛在作用靶點 31 個對應(yīng)其 13 個活性化合物，4 8 條信號通路， 因此葛花治療 ALD 具有多成分、多靶點和多通路的特點。

篩選出的有效化合物為黃酮類、甾醇類和苯丙酸類等化合物，其中槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、葛花苷（Kakkalide）、刺芒柄花素（formononetin）等可能是葛花治療 ALD 的關(guān)鍵化合物。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)槲皮素、山奈酚具有抗病毒、抗氧化、抗炎和增強免疫調(diào)節(jié)等功效[20-24]，且有研究表明，槲皮素是通過抑制促炎因子分泌和提高機體抗氧化能力達到護肝的療效[25-26]，山奈酚可能通過減少自由基的生成而有治療急性肝損傷的療效[27]， 刺芒柄花素、 葛花苷、 豆甾醇都能抑制炎癥反應(yīng)[28-30]，說明這些化學(xué)成分在治療 ALD 過程中具有重要作用。

31 個潛在靶點均存在蛋白互作作用，通過自由度、介數(shù)、中心度篩選出 12 個關(guān)鍵靶點，其中炎癥因子包括白介素 1β（IL-1β）、白介素 6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF），參與各種炎癥反應(yīng)的進行，刺激趨化因子如趨化因子 8（CXCL8）、趨化因子 2（CCL2）等的產(chǎn)生，NOS3 具有調(diào)節(jié)血管張力、減少鈣超載和抑制炎性反應(yīng)等作用，SIRT1、NFE2L1、MPO、PON1 都與抗氧化或氧化應(yīng)激有關(guān)[31-35]。已有研究表明 IL-6、TNF、CXCL8、IL-1β、IL-10 等在治療酒精性肝損傷中發(fā)揮重要作用[36-38]。

對 31 個潛在作用靶點進行 GO 富集分析發(fā)現(xiàn)， 葛花治療 ALD 主要涉及的生物過程有炎癥反應(yīng)、 RNA 聚合酶 II 啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、血管生成的正調(diào)控和凋亡過程負(fù)調(diào)控等；在分子功能中，主要影響細胞因子活性、氧化還原酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、藥物結(jié)合、酶結(jié)合等。在 KEGG 通路富集分析中發(fā)現(xiàn)，葛花治療 ALD 通路主要涉及 NOD 樣受體信號通路、細胞色素 P450 對外源性藥物代謝的影響、Toll 樣受體信號通路、TNF 信號通路、炎癥性腸病、FoxO 信號通路、MAPK 信號通路、HIF-1 信號通路等。現(xiàn)代研究表明，HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、MAPK 信號通路、NOD 樣受體信號通路、FoxO 信號通路、細胞色素 P450 對外源性藥物代謝的影響等與酒精性肝損傷有關(guān)[37-41]，一定程度上表明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法的可靠性。

4 結(jié) 語

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法首次對葛花治療酒精性肝損傷的作用機制進行了系統(tǒng)的研究。利用 OB 和 DL 值篩選出 18 個有效化合物，其中 13 個化合物與酒精性肝損傷疾病靶點有 31 個共有靶點；共有靶點進行生物信息富集分析，得到 222 個生物過程、15 個細胞組分、32 個分子功能以及 48 條信號通路。該研究充分體現(xiàn)了葛花治療 ALD 多組分、多靶點和多通路特點，可為進一步研究葛花解酒作用及其作用機制提供參考。但本研究還存在一定的局限性，只能提供初步的探索，后期仍需要進一步的實驗來驗證本研究的初步探索。