通痹顆粒對膠原性關節炎大鼠Wnt信號通路DKK1、β-catenin表達的影響

柳玉佳 王莘智 吳伊瑩 廖亮英 范伏元

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性疾病，其特征是侵蝕性關節炎的慢性、進行性發展，可發生于任何年齡[1]。目前RA的發病機制尚不清楚，基本病理表現為滑膜炎和異常增生的血管翳，關節軟骨和骨的進行性破壞，最終引起關節畸形和功能喪失[2-3]。因此，早期、規范診治是控制RA發生發展，改善預后的根本[4]。Wnt/β-catenin信號通路被稱為經典Wnt信號通路，與RA的炎癥和骨破壞密切相關[5]。通痹顆粒為我院的內部制劑，實驗研究證實其可以緩解佐劑性關節炎大鼠的關節炎癥[6]，但具體機制尚未完全明確。本研究擬通過觀察Wnt/β-catenin信號通路重要的負性調節因子Dickkopf 1（DKK1）和關鍵蛋白β-連環蛋白（β-catenin）的表達情況，探討通痹顆粒對RA模型——膠原性關節炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠滑膜組織異常增生的調控機制，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SD雌性大鼠，SPF級，體重200～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證編號：SCXK（湘）2009-0004，于湖南中醫藥大學實驗中心室完成動物飼養。

1.2 藥物與試劑 通痹顆粒，藥物組成：當歸30 g、黃芪15 g、白芍10 g、川芎10 g、全蝎5 g、僵蠶10 g、乳香10 g、沒藥10 g、桂枝10 g、黃柏10 g、甘草3 g，顆粒劑，用量為中草藥的等效劑量，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑科提供，并由煎藥室制備濃縮為含生藥2 g/mL。雷公藤多苷片，浙江得恩德藥業有限公司生產，國藥準字：Z33020422，規格：10 mg×50片。牛Ⅱ型膠原、不完全弗氏佐劑，購自美國Chondrex公司；DKK1 ELISA試劑盒、β-catenin ELISA試劑盒，購自武漢菁禾生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 YLS-TA型足趾容積測量儀（山東醫學科學院設備站）；石蠟包埋機、切片機（德國Leica公司）；光學顯微鏡、圖像分析儀（日本OLYMPUS公司）；酶標儀（美國Biotech公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 40只大鼠適應性飼養7 d后，隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組和通痹顆粒組，每組10只。除空白組外其余各組予牛Ⅱ型膠原誘導CIA大鼠模型，空白組注射等量生理鹽水。造模方法參考文獻[7]，將牛Ⅱ型膠原蛋白冰浴完全溶解在冰醋酸中，并用不完全弗氏佐劑乳化，制備牛Ⅱ型膠原，通過皮內注射0.2 mg于大鼠尾根部進行初始免疫，7 d后同前法以0.1 mg進行增強免疫。初次免疫后第21天進行造模評判，大鼠關節炎指數評分≥6分，則為造模成功。本研究造模過程順利，二次免疫后評判均成功造模。

2.2 給藥方法 成功造模后按人鼠體表面積換算藥物劑量進行灌胃給藥。通痹顆粒組：予通痹顆粒濃縮液灌胃，每日20 g/kg。陽性藥物組：雷公藤多苷片溶于生理鹽水，每日灌胃劑量約為2.4 mg/kg。空白組和模型組予等量生理鹽水灌胃。各組均每日灌胃1次，連續14 d。

2.3 指標檢測 所有大鼠于治療前和治療第7、14天時觀察關節病變情況，進行關節炎指數評分，測量關節腫脹度。灌胃第15天通過腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉處死，于右后足踝關節剝離滑膜用于滑膜組織病理學檢查，腹主動脈采血用于血清學指標檢測。

2.3.1 關節炎指數評分 參照Wood氏的關節炎評估標準[6]，根據關節病變程度按照5級量表法進行評分：關節不紅不腫計為0分，只有小趾關節紅腫為1分，僅為趾關節和足跖出現紅腫計為2分，腳踝以下的所有足爪腫脹為3分，全部足爪均出現紅腫計為4分。對每個關節的積分累積即為關節炎指數，最大值16分。分別于治療前和治療第7、14天進行評估。

2.3.2 關節腫脹度測量 采用足跖腫脹度測量儀對大鼠左后足踝關節進行評估，通過足跖容積的變化程度來估測大鼠的關節腫脹度。分別于治療前和治療第7、14天進行測量。

2.3.3 蘇伊紅（HE）染色法觀察滑膜病理形態 滑膜組織在10%福爾馬林液中固定24 h，脫鈣，自流水沖洗，常規脫水，石蠟包埋切片，HE染色，中性樹脂封片，在200倍光學顯微鏡下觀察滑膜組織形態。

2.3.4 酶聯免疫吸附（ELISA）法測定血清DKK1、β-catenin水平 全血靜置1 h，以離心半徑10 cm，3 000 r/min的速度離心20 min，取出上層血清ELISA法測定DKK1、β-catenin水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

2.4 統計學方法 采用SPSS 16.0統計學軟件，計量資料采用（-x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗和單向ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠治療前后關節炎指數評分比較 治療前和治療第7、14天，除空白組外其余各組大鼠關節炎指數評分均明顯高于空白組（P＜0.01）；治療第7、14天，各治療組大鼠關節炎指數評分均明顯低于本組治療前和模型組治療同時期（P＜0.05），治療第14天指標明顯低于治療第7天（P＜0.05），陽性藥物組與通痹顆粒組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠治療前后關節炎指數評分比較（±s） 單位：分

表1 各組大鼠治療前后關節炎指數評分比較（±s） 單位：分

注： 與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05 ；與本組治療前比較，#P＜0.05；與本組治療第7天比較，★P＜0.05。

組別 動物數/只 治療前 治療第7天 治療第14天空白組 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 10 8.60±1.07** 9.10±0.85** 9.80±0.21**陽性藥物組 10 8.70±1.13** 7.30±0.41**▲# 5.30±0.27**▲#★通痹顆粒組 10 8.60±0.98** 7.10±0.37**▲# 5.10±0.32**▲#★

3.2 各組大鼠造模前及治療前后關節腫脹度比較 治療前和治療第7、14天，除空白組外其余各組大鼠關節腫脹度均明顯高于空白組（P＜0.05）；治療第7、14天，各治療組大鼠關節腫脹度均明顯低于本組治療前和模型組治療同時期（P＜0.05），治療第14天指標明顯低于治療第7天（P＜0.05），陽性藥物組與通痹顆粒組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠治療前后關節腫脹度比較（±s） 單位：mL

表2 各組大鼠治療前后關節腫脹度比較（±s） 單位：mL

注： 與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與本組治療前比較，#P＜0.05；與本組治療第7天比較，★P＜0.05。

組別 動物數/只 治療前 治療第7天 治療第1 4天空白組 1 0 1.6 6±0.3 8 1.6 3±0.3 5 1.6 5±0.1 7模型組 1 0 2.1 3±0.5 6* 2.1 5±0.3 7* 2.0 9±0.2 3*陽性藥物組 1 0 2.1 4±0.4 7* 1.9 2±0.4 3*▲# 1.7 8±0.1 5*▲#★通痹顆粒組 1 0 2.1 4±0.5 1* 1.8 9±0.3 5*▲# 1.7 4±0.1 4*▲#★

3.3 各組大鼠關節滑膜病理學情況比較 空白組滑膜組織未增厚，滑膜細胞排列整齊，未觀察到血管增生及炎癥細胞浸潤；模型組滑膜組織明顯增厚，細胞排列紊亂，血管明顯增生，大量炎癥細胞浸潤；陽性藥物組滑膜組織略微增厚，細胞排列較整齊，血管輕度增生，小量炎癥細胞浸潤；通痹顆粒組滑膜組織略微增厚，滑膜細胞排列較有序，血管增生不明顯，可見少量炎性細胞浸潤。提示陽性藥物組和通痹顆粒組CIA大鼠病變關節的滑膜病理組織結構均有一定的好轉，通痹顆粒組稍優于陽性藥物組。見圖1。

圖1 各組大鼠滑膜組織病理學情況（HE，×200）

3.4 各組大鼠血清DKK1、β-catenin表達比較 與空白組比較，其余各組大鼠血清DKK1、β-catenin均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組血清DKK1、β-catenin水平明顯降低（P＜0.05）；陽性藥物組和通痹顆粒組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清DKK1、β-catenin表達比較（±s）

表3 各組大鼠血清DKK1、β-catenin表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數/只 DKK1/（ng/mL） β-catenin/（pg/mL）空白組 10 3.53±1.27 23.41±4.28模型組 10 9.36±1.22* 29.23±5.15*陽性藥物組 10 6.15±1.18*▲ 26.04±4.42*▲通痹顆粒組 10 5.97±1.09*▲ 25.89±3.77*▲

4 討論

RA的主要病理變化是炎癥和滑膜的異常增殖，其特征在于血管新生、關節軟骨和骨損傷。Wnt/β-catenin信號通路是細胞增殖分化的關鍵調節途徑，與RA的發病機制密切相關。DKK1為通路上游的重要負性調節因子，β-catenin為通路的關鍵蛋白，與Wnt/β-catenin信號通路調控作用密切相關。肖光華等[8]發現Wnt通路參與了CIA大鼠的發病機制，可能通過上調DKK1、下調骨保護素誘導關節炎癥。XIAO等[9]實驗證實，RA患者滑膜細胞中β-catenin的表達增加，通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進而抑制滑膜炎性可能是RA治療的關鍵。SANTOS等[10]發現，Wnt通路抑制劑DKK1的過度表達與RA骨質破壞有關，可以作為RA關節破壞的生物標志物。MATZELLE等[11]研究證實，RA骨侵蝕的修復發生在炎癥消退的環境中，與Wnt/β-catenin信號通路密切相關。因此，研究Wnt/β-catenin信號通路在RA炎癥及骨破壞的雙向調節作用是非常重要的[12]。

RA可歸屬于中醫學“歷節病”“鶴膝風”等范疇。《證治匯補》曰：“久則須分氣血虛實，痰瘀多少治之。”本課題組根據前期研究[13]及臨床觀察，提出了RA的“虛”“痰”“瘀”論治，并研制出具有“益氣養血，化痰逐瘀”功效的通痹顆粒。方中重用當歸為君，養血活血、止痛利筋；黃芪補氣益衛，以資氣血生化之源，白芍斂陰養血、緩急止痛，二者共為臣藥；川芎行氣活血，和血而不滯血；全蝎、僵蠶治風化痰、散結通經；乳香、沒藥通氣活血，不至耗傷氣血；桂枝溫通經脈、散寒止痛，使痰瘀易散；黃柏味苦性寒，能清熱燥濕、瀉火解毒、消腫祛腐，方中取反佐之意以清郁久所化之熱；甘草為使，調和諸藥。凡RA具有氣血虧虛、痰瘀互結者均可使用。實驗研究證實，通痹顆粒可緩解佐劑性關節炎大鼠的關節炎癥，并且對下丘腦-垂體-腎上腺軸及血清白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）具有一定的調節作用，但具體機制尚未完全明確[6]。

本研究結果顯示，通痹顆粒治療后，CIA大鼠的關節炎癥指數和關節腫脹度明顯降低，提示通痹顆粒可以改善CIA大鼠的關節炎癥。滑膜病理檢查提示通痹顆粒治療后CIA大鼠關節滑膜組織及血管增生均明顯改善，血清DKK1、β-catenin水平均明顯降低，提示通痹顆粒對CIA大鼠的治療作用可能是通過對Wnt/β-catenin信號通路的調節作用實現的。通痹顆粒通過Wnt/β-catenin信號通路下調DKK1、β-catenin表達，從而防止異常血管增生和滑膜炎癥細胞浸潤，可能是通痹顆粒治療CIA的機制之一。但因Wnt/β-catenin信號通路相關因子的表達受多重因素影響，其具體的作用機制尚需進一步研究。此外，我們臨床發現通痹顆粒對RA并發的抑郁癥也有一定的緩解作用，下一步擬通過臨床及實驗研究觀察通痹顆粒對RA并發抑郁癥的干預作用，并探索其可能的機制。