CAR-T的發(fā)展歷程及實體瘤治療難點

馬金燕，楊勇，王昀

(中國藥科大學藥物科學研究院，江蘇 南京 211198)

腫瘤免疫療法是繼手術、放療、化療之后的第四大腫瘤治療手段，相較于其他形式的腫瘤免疫療法，過繼性細胞療法(adoptive cell therapy，ACT)具有更多的優(yōu)勢及更好的療效[1]，在這之中，嵌合抗原受體T細胞療法(CAR-T)療法的發(fā)展最為迅猛。CAR-T是利用人體自身免疫細胞來發(fā)揮療效的一種治療手段，該療法需從患者外周血中分離出T細胞，通過基因工程手段進行修飾，使其能夠表達相應靶點的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)，并在體外進行擴增培養(yǎng)，再重新輸回患者體內殺傷腫瘤細胞，并激活人體免疫系統(tǒng)的記憶達到持久的作用[2]。

1 CAR-T的發(fā)展歷程

CAR-T的概念于1989年由Zelig Eshhar首次提出，他將抗體的輕重鏈與T細胞受體(T cell receptor，TCR)的恒定區(qū)相連，構建出不依賴于主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)的嵌合T細胞受體基因片段，并驗證其表達和功能[3]。基于以上結果，他提出將具有腫瘤特異性的合成T細胞受體用于治療腫瘤的可行性。隨后，他又利用單鏈抗體(single chain fragment of variable region，scFv)替換抗體的輕重鏈形成新的受體，這也預示著第一代CAR-T的誕生[4]。

CAR的結構主要由3部分組成，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內信號域[5]。胞外區(qū)[6]包括抗原結合區(qū)域和連接用的鉸鏈區(qū)，抗原結合區(qū)域主要來源于抗體的scFv，scFv由一個完整抗體純化而來，通過一條肽鏈將抗體可變區(qū)的重鏈和輕鏈連接在一起。相較于TCR識別腫瘤抗原的復雜性，scFv識別抗原不依賴于MHC，但同時保留了特異性。除了scFv之外，其他的多肽配體或蛋白經過修飾后也能作為CAR的胞外區(qū)，例如修飾白細胞介素-13(IL-13)分子制備胞外域得到治療膠質母細胞瘤的IL-13Rα2特異性的CAR-T，并在人體上進行了測試[7]。跨膜區(qū)處在胞外區(qū)和胞內信號域之間，一般來源于T細胞分子的現有序列。胞內域對于激發(fā)免疫反應至關重要，通常包括共刺激信號域和活化區(qū)域，共刺激信號域[8]主要用于提供共刺激信號來增強T細胞的能力，如CD28和4-1BB(CD137)。而T細胞的活化依賴于免疫受體酪氨酸活化基序(immuno-receptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)，一般選用TCRζ(CD3ζ)[9]，也有效果略差的FcRγ[10]。目前，根據不同的胞內結構域，可將CAR-T分為四代。

1.1 第一代CAR-T 第一代CAR-T的胞內區(qū)僅包含CD3ζ或FcRγ，為T細胞的活化提供刺激信號[4]。這類CAR-T雖然可以靶向腫瘤細胞，但在臨床試驗中發(fā)現其增殖能力較弱，治療效果一般或無效[11]。在一項卵巢癌臨床試驗中發(fā)現，葉酸受體特異性的重定向T細胞未減輕腫瘤負荷，實時監(jiān)測到T細胞在絕大部分患者中存在了將近3周，但未到達腫瘤部位[12]。Park等[13]利用靶向CD171(L1-cell adhesion molecule)的CAR-T治療了6位母細胞瘤患者，輸注后未發(fā)現明顯毒性，其中5位患者體內的CAR-T僅維持了不到7 d，而另1位荷瘤較輕的患者得到緩解，CAR-T維持了6周左右。隨著一代CAR-T臨床數據的增多，研究者們意識到需要改進CAR的設計來提高抗腫瘤療效。

1.2 第二代CAR-T 第一代CAR-T在體內增殖困難，療效甚微，為解決這一問題，第二代CAR-T額外增加了一個共刺激信號，目前研究較多的包括CD28、4-1BB(CD137)、CD27和ICOS(inducible costimulatory molecule)。研究者[14]比較了有無共刺激信號的臨床效果差異，他們設計了兩種靶向CD19的CAR-T，一種僅編碼TCR的CD3ζ鏈，另一種包含CD3ζ鏈和CD28的胞內域，用于治療非霍奇金淋巴瘤患者，實驗結果表明，含有CD28胞內結構域的CAR-T具有更強的擴增和持久性。Lami等[15]構建了含有4-1BB信號轉導域的靶向CD19的CAR-T來治療B細胞系急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)，以患者來源的白血病細胞為靶細胞，在效靶比僅為0.01的情況下，該T細胞在五天內清除了大部分ALL細胞。與缺乏4-1BB的CAR-T相比，這些細胞擴增速率和白細胞介素-2(interleukin 2，IL-2)產生速率均更高，表明二代CAR-T具有更高的臨床價值。

1.3 第三代CAR-T 第三代CAR-T在第二代的基礎上進行改造，胞內域包含一個活化區(qū)和兩個共刺激信號域。一項先導臨床試驗研究了一個同時具有CD28和4-1BB共刺激結構域的CD20特異性CAR-T對淋巴瘤的作用，三例患者在接受T細胞輸注后得到了不同程度的緩解，并在腫瘤部位檢測到修飾的T細胞，而外周血中低水平存在長達1年[16]。Pule等構建并比較了分別具有CD28、OX40和同時包含兩個共刺激信號結構域的靶向神經節(jié)苷脂(ganglioside，GD2)的CAR-T，結果顯示具有雙重共刺激信號的第三代CAR T增殖時間更長、T細胞活化信號更強，分泌細胞因子IL-2的能力也得以增強[17]。但同時也有數據[18]指出與三代CAR-T相比，二代CAR-T具有更強的信號轉導能力，二代和三代CAR-T孰優(yōu)孰劣仍有待實驗證明。

1.4 第四代CAR-T 第四代CAR-T在第二代或第三代的基礎上，于胞內區(qū)進一步加入自殺基因或促炎細胞因子，以此增強對T細胞反應調控或通過釋放不同的細胞因子來招募其他的免疫細胞至腫瘤部位，產生不依賴于T細胞的殺傷作用[19]。白細胞介素-12(interleukin 12，IL-12)促進干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)的釋放，NK細胞和T細胞的增殖，抑制腫瘤誘導的調節(jié)性T細胞的產生并提高腫瘤的清除效率[20]。Gray等[21]構建了具有和不具有IL-12分泌的靶向CD19的CAR-T，并在小鼠淋巴瘤模型中測試兩者的區(qū)別。Gray發(fā)現表達IL-12的CAR-T能夠根除已建立形成的B細胞淋巴瘤，并顯著改善小鼠生存率。該療法不僅依賴于CAR-T的直接殺傷作用，還通過募集宿主免疫細胞來產生免疫應答殺傷腫瘤。

2 實體瘤相關靶點

目前，第二代CAR-T仍處于研究的主流地位，對于血液瘤而言具有較好的療效，2017年就有兩款CAR-T療法獲批上市，用于治療急性淋巴細胞白血病的Kymriah和治療非霍奇金淋巴瘤的Yescarta。基于血液瘤治療的成功，第三、四代CAR-T應運而生，擴增和殺傷能力都得到了明顯的改善，因此研究者們將其應用于實體瘤的治療中，并研究不同腫瘤抗原作為靶點時CAR-T的治療效果。

2.1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3) GPC3是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的一員，借由糖基磷脂酰肌醇附著在細胞表面[22]，并在細胞生長、分化和遷移過程中發(fā)揮重要的作用。多項研究表明，GPC3可以作為肝癌的特異性靶點，在人肝細胞癌中高表達但在正常組織中表達有限，同時GPC3的高表達與肝細胞癌患者的預后呈一定的正相關[23]。Gao等[24]首次構建了以GPC3為靶點的第三代CAR-T，并檢測其在肝細胞癌中的療效，體內外試驗結果均證明靶向GPC3的CAR-T可以有效清除GPC3陽性的肝癌細胞，且殺傷效果與靶細胞中GPC3表達水平呈正相關。該研究也為肝細胞癌的免疫治療提供了新的解決思路。

2.2 人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2) HER2是受體酪氨酸激酶中表皮生長因子受體家族的一員，是胚胎發(fā)育和成人組織細胞分化增殖的必需介質之一[25]。大量研究表明HER2的過度擴增和高表達與包括胃癌、胰腺癌和乳腺癌等在內的多種腫瘤的不良預后有關。有研究者[26]進行了針對晚期膽管癌和胰腺癌的HER2靶向的CAR-T治療，在該Ⅰ期臨床試驗中，所有患者均出現一定的臨床應答，其中1例獲得了4.5個月的部分緩解，5例病情穩(wěn)定，中位無進展生存期達4.8個月，該研究數據在一定程度上證明了靶向HER2的CAR-T療法的安全性和可行性。

2.3 間皮素(mesothelin，MSLN) MSLN是一種通過糖基磷脂酰肌醇錨定在細胞質膜上的糖蛋白，在腹膜、胸膜腔和心包的正常間皮細胞上表達，同時在多種腫瘤中高表達，促進癌細胞的增殖和局部侵襲轉移，可作為診斷和預后的檢測物之一[27]。由于MSLN在正常組織中的分布有限而在某些腫瘤組織中高度表達，它也成為免疫治療的研究靶點，一項Ⅰ期臨床試驗[28]利用MSLN特異性的CAR-T治療6例胰腺導管腺癌患者，所有患者均未出現細胞因子釋放綜合征或神經毒性等，其中2例患者病情穩(wěn)定，無進展生存時間分別為3.8和5.4個月，斷層掃描監(jiān)測到3例患者的腫瘤病灶代謝穩(wěn)定，1例證實表達MSLN的患者活躍體積明顯下降，說明以MSLN為靶點的CAR-T治療胰腺導管腺癌的方法是可行的，具體的激活時間和治療效果等仍需進一步的研究。

3 實體瘤CAR-T治療的難點

雖然CAR-T在治療實體瘤中取得了初步的療效，但其藥效遜于血液瘤。這主要與實體瘤的特性相關，與血液瘤相比，實體瘤治療需要解決更多的難題。

3.1 靶點的選擇 由于實體瘤的高度異質性，很難篩選到合適的表面抗原[29]。目前大部分研究仍選用腫瘤相關性抗原，這些抗原往往在正常組織中少量表達，因此脫靶毒性是腫瘤相關抗原CAR-T難以回避的問題。一位轉移性結腸癌患者[30]在接受靶向HER2的CAR-T治療后死亡，后發(fā)現是CAR-T識別到肺上皮細胞低水平的HER2而觸發(fā)釋放大量細胞因子導致的。此外，實體瘤的異質性表現在原發(fā)性腫瘤和繼發(fā)性腫瘤以及相同腫瘤的不同部位之間，腫瘤生長過程中也會發(fā)生異變，這就使得治療靶點難以選擇。一項靶向表皮生長因子受體變異體Ⅲ(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ)的研究[31]發(fā)現CAR-T輸注后部分患者腫瘤中靶抗原水平降低，但療效不佳，不同時間檢測發(fā)現患者腫瘤表面EGFRvIII的表達發(fā)生了廣泛的突變，導致CAR-T無法識別變異的抗原。因此，找到合適的治療靶點是實體瘤CAR-T治療急需解決的首要問題。

3.2 實體瘤浸潤 除去少數研究使用的瘤內注射方式，CAR-T的給藥方式主要還是集中在靜脈輸注，CAR-T細胞需要從外周血中循環(huán)至腫瘤部位才能發(fā)揮殺傷作用。相較于血液瘤所處的均質環(huán)境，實體瘤所處的環(huán)境復雜多變，阻礙了CAR-T的浸潤。實體瘤缺乏包括高內皮微靜脈(high endothelial venules，HEVs)在內的各種成熟血管，但周圍促血管生成因子的過度表達又誘導了不同于正常血管的腫瘤血管生成，集中在腫瘤邊緣區(qū)域且結構不規(guī)則伴有過度的分支[32]，使得運輸受阻。同時，實體瘤外部具有致密的纖維組織構成的物理屏障[33]，導致CAR-T難以穿透。因此，相較于抗腫瘤血管生成，研究者們越來越傾向于腫瘤血管正常化的理論，利用腫瘤血管正常化為CAR-T的浸潤提供通道，增加CAR-T與腫瘤細胞接觸的概率從而提高CAR-T的殺傷效果[34]。

3.3 腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境[35]是指腫瘤產生和生存的內環(huán)境，主要由腫瘤細胞、細胞外基質、周圍血管、其他細胞(如免疫細胞和成纖維細胞)以及各種分泌因子等組成。越來越多的研究表明，抑制性腫瘤微環(huán)境促進了腫瘤的生長和轉移，阻礙了免疫細胞的應答并抑制抗腫瘤療法的療效。腫瘤微環(huán)境是一種低pH、低氧、低營養(yǎng)、高滲透的惡劣環(huán)境[36]，極不利于T細胞的存活。此外，微環(huán)境中還包含腫瘤相關的巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)、骨髓源性的抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和調節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)等多種免疫抑制性細胞[37]，通過相關的細胞因子和抑制性受體來發(fā)揮抑制作用。以TAMs為例，其主要極化為替代激活型即M2型巨噬細胞[38]，經由L-精氨酸的代謝產生活性氧，高表達程序性死亡配體1(programmed cell death receptor ligand 1，PD-L1)，同時釋放IL-10等細胞因子誘導趨化Treg等多個途徑實現對T細胞功能的抑制。

4 結語與展望

CAR-T治療腫瘤的研究仍充滿了未知，這既是挑戰(zhàn)也是轉機，目前已出現了多種優(yōu)化方案。第一，設計雙靶點CAR-T來減少抗原逃逸現象，Hegde等[39]報道了一種雙特異性CAR分子，將Her2和IL-13Rα2的抗原識別區(qū)串聯(lián)在一起并取名為TanCAR，體內外試驗均證明該雙靶點CAR-T的殺傷效果強于單一靶點CAR-T。第二，提高CAR的靈活性和通用性，包括利用接頭系統(tǒng)，在不改變CAR結構的前提下，由接頭實現不同的靶向性部分。例如連有單體鏈霉親和素的CAR-T與生物素化腫瘤相關性抗原特異性抗體聯(lián)合使用以實現多靶點同時殺傷[40]；采用亮氨酸拉鏈作為接頭系統(tǒng)開發(fā)出“分離、通用和可編程(split，universal and programmable，SUPER)”的CAR-T，簡稱SUPER CAR系統(tǒng)以提高免疫療法的安全性及有效性[41]。同時，還有利用基因編輯技術CRISPR/Cas9技術對CAR-T細胞進行改造，或切除TCR等基因產生同種異體的通用CAR-T[42]，或敲除抑制性受體提高CAR-T的殺傷能力[43]。第三，CAR-T與其他免疫療法聯(lián)用，如對CAR-T細胞進行改造后使其同時能夠分泌雙特異性抗體(bispecific T-cell engager，BiTE)，利用CAR-T發(fā)揮直接殺傷作用的同時，釋放抗體進一步激活自身免疫功能，減少免疫逃逸，從而發(fā)揮更強的抗腫瘤效果[44]。我們相信在不久的將來，隨著免疫療法的發(fā)展和臨床數據的豐富，實體瘤的治療難點一定會得以解決，更完善的CAR-T療法必將出現，造福于更多的腫瘤患者。