腱病動物模型研究進展

張柏青，吳 瑕，李春寶，劉玉杰

1解放軍總醫院第一醫學中心 骨科，北京 100853；2中國質量認證中心，北京 100070

腱病通常指由于肌腱過度的使用和反復牽拉引起的肌腱膠原纖維退行性病變，繼發臨床癥狀和病理改變[1-3]。為了研究腱病的發病機制和治療方法，動物模型必不可少[4-6]。目前用于研究腱病的發病機制和干預治療的動物模型較少，一部分是采用物理致病因素誘導腱病，另一部分為化學物質注射誘導造模。每種動物模型都有各自的優缺點，但無論哪種模型都存在著與腱病實際臨床癥狀不一致的問題。本文綜述并分析了近年來腱病動物模型的研究，以期為進一步研究提供參考。

1 常用腱病動物模型

腱病造模動物目前多為大鼠和兔，其有成本低、容易獲得等優點[7-8]。兔與大鼠比較，標本量更大，在進行外科操作時更容易，但其生存能力沒有鼠類強，容易死亡，并且進行免疫化學方面檢測時可用的試劑盒相對較少，故首選鼠類作為造模動物[9]。誘導造模分為兩類，一類是機械過載模型，包括動物跑臺、電刺激、直接重復機械牽拉等，其中動物跑臺模型最為常用；另一類為化學誘導造模，包括膠原酶、細胞因子、前列腺素、氟喹諾酮、皮質類固醇類等注射模型，其中膠原酶注射模型最為常用[10]。

1.1 動物跑臺模型 此為常用腱病造模方法，動物跑臺主要在于模仿人類肌腱的過度使用，成功地造出了大鼠岡上肌腱和跟腱的腱病模型[11]。岡上肌腱病模型方法：大鼠在跑臺上進行10°的下坡跑，17 m/min，1 h/d，5 d/周。跟腱模型采取10°上坡跑的方式。1周后生物力學檢測可以發現肌腱組織的彈性模量及最大應力減少。組織學觀察到肌腱組織中細胞增多，膠原蛋白分解，細胞形態學發生變化，肌腱組織橫截面面積增大[12]。Cho等[13]研究表明，8周后電鏡下肌腱單位面積內膠原纖維密度降低，直徑粗大的纖維比例降低，直徑細小的纖維比例增加，大鼠肌腱中細胞及糖胺聚糖含量增加，膠原纖維分解，并且表現出不同程度的軟骨細胞表型表達。另有研究顯示，與興奮性和凋亡相關的谷氨酸信號和應激反應基因也顯著上調，表現為胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)的活性和數量增加[14]。促炎癥基因COX-2表達增加，表明炎癥微環境下膠原纖維損傷、修復、再損傷的病變過程[15]。

跑臺奔跑動物產生周期疲勞，導致腱病的發生[16]。但由于大鼠自身奔跑能力較強，而且很難強迫其進行超強度的運動量，影響成功造模。Kim等[17]通過對大鼠跟腱進行針刺預損傷進行造模，結果顯示較單純機械過載建模時間更短、成功率更高。如何進一步精確量化運動量，如何進一步采取有效的方法讓實驗動物進行超負荷運動造模，需要進一步的探索研究。因此，進行正式實驗前，實驗動物都要接受一定量的適應性訓練，以便挑選出能夠適應和配合實驗的動物。此外腱病為反復損傷未能完全愈合導致，一般休息至少2周左右；而動物模型沒有休息再損傷的過程，因此不能完全復制臨床腱病的病程，并且這種動物造模所需的時間較長[18]。另有文獻報道跑臺模型造模效果不明確，Huang等[19]研究結果顯示，運用跑臺造模后，通過幾何測量和機械測試分析發現跟腱沒有變化。Bell等[20]研究發現適量的運動有助于腱病的愈合。出現這種情況的原因可能在于這兩項研究采用了不一樣的評估方法[21]。

1.2 膠原酶注射誘導模型 膠原酶注射的腱病模型廣泛用于馬、兔、鼠的跟腱、髕腱及岡上肌腱等部位。在兔跟腱內注射膠原酶，4周時肌腱周圍血管增生和纖維化；16周時觀察到肌腱組織黏液樣變化，纖維化和膠原束排列混亂及腱細胞的數量也不斷增加。有研究顯示在第4周時肌腱的橫截面積增加，但在16周時并未有明顯區別；膠原纖維含量在第4周時下降，在16周時膠原纖維的交聯程度增加；最終，肌腱的負載呈下降趨勢[22]。另一項研究表明，膠原酶誘導的髕腱損傷模型中可再現腱病的主要特征：血管增多、細胞增多、軟骨細胞樣變化、周圍基質組織的降解、組織修復、細胞外基質失調、蛋白聚糖和膠原蛋白的持續表達類型異常、腱組織中疼痛相關的P物質及降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)表達增加[23]。生物力學顯示，在注射膠原酶后，兔和鼠的肌腱抗拉強度下降。另有文獻報道了膠原蛋白Ⅲ的表達更高，導致力學性能下降[24]。

一些作者反對注射膠原酶和炎癥物質造模，理由是膠原酶和炎癥引起的損傷物質與自然產生的物質缺乏相似性。長期過度使用肌腱導致的損傷可能與急性損傷有不同的機制。但實際上，人類腱病的晚期組織病理學檢查未發現炎癥并不代表早期沒有炎癥。注射膠原酶第3天檢測到白細胞增加，但在第7天后恢復正常[25]。另一方面的質疑在于這種損傷的修復方式與臨床上腱病患者的修復方式不一致。受損的細胞外基質和基質成分可以導致肌腱對力刺激及損傷的敏感度更高，“惡性循環”導致腱病[26]。

盡管存在差異，但研究證明了模型再現臨床腱病的許多特征，包括基質退化、細胞增多、血管的增加和缺陷的愈合，其傷害的嚴重程度很容易控制，與跑臺相比有著更好可重復性[27]。但膠原酶注射模型產生機制不同于常規腱病，尤其是對腱病進行機制研究時，不適宜作為研究模型。

2 腱病動物模型的病理及生物力學表現

2.1 組織病理學及電鏡 腱病組織表現為細胞密度及血管的增加，蛋白多糖等基質的沉積，細胞外基質降解，細胞核變圓以及軟骨細胞樣改變，腱細胞數量密度增加，但凋亡的數量也增加，偶有脂肪和上皮化生改變和基質金屬蛋白酶表達的改變[21,28-29]。細胞外基質的變化可導致肌腱退變，嚴重時會發生肌腱斷裂[8,30]。腱病組織HE染色顯示肌腱組織膠原纖維排列紊亂，結構明顯破壞，天狼星紅染色后在偏振光顯微鏡下觀察示肌腱組織中偏紅色的Ⅰ型膠原纖維明顯減少，綠黑色的Ⅲ型膠原纖維明顯增多，整個膠原基質排列雜亂無章，失去正常肌腱組織結構[21,28-30]。劉春雨等[31]報道腱病組織膠原成分異常，Ⅲ型與Ⅰ型膠原的比例顯著高于正常，此外還包括膠原纖維排列紊亂、長度不均、直徑減小等組織學表現，新生血管形成增加并內向生長，纖維間糖胺聚糖成分增加，有時還有肌腱鈣化的出現。

電鏡下觀察發現肌腱3周內膠原纖維直徑增粗，6周后單位面積內膠原纖維密度降低，直徑粗大的纖維比例降低，直徑細小的纖維比例增加[13]。腱細胞呈隨機散在分布，形態為圓形，細胞核形態破壞，出現凋亡樣特征。膠原纖維彌漫性破壞，非膠原細胞外基質替代膠原纖維[32]。

2.2 腱病組織中蛋白聚糖、過氧化物還原酶、基質金屬蛋白酶1、胰島素樣生長因子1、骨形態發生蛋白和一氧化氮合成酶基因表達增多，進而導致腱病組織膠原纖維退化，膠原結構排列紊亂[33]。另有研究表明，腱病組織中P物質、CGRP、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和 α1-腎上腺素能受體 (α1 adrenergic receptor，α1-AR)、乙酰膽堿 (acetylcholine，ACh)、谷氨酸、COX-2，前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)等疼痛相關神經肽基因表達增多[34-36]。跑臺模型中腱細胞內源性表達多種炎癥介質，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1b(interleukin-1b，IL-1b)、IL-6和IL-10、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等，導致水腫、充血、缺氧，進而產生自由基，引發慢性肌腱損傷[37]。

肌腱生物力學指標的下降也是評價指標之一。生物力學檢測顯示剛度、最大載荷、極限強度和彈性模量都下降，Jafari等[12]報道大鼠腱病模型的跟腱極限拉力中值下降了37.7%，剛度中值下降了28.1%。Bell等[20]報道跟腱的最大載荷相對于正常對照組下降了66%。Dan等[38]對大鼠分別進行髕腱建模，結果發現低強度組大鼠髕腱的平均衰竭力為56.8 N，而高強度組則為46.0 N。Longu等[7]報道最大斷裂拉力及彈性模量均明顯下降。可見肌腱的組織結構改變是肌腱生物力學性能發生變化的物質基礎。

3 結語

目前還沒有一個完美的腱病動物模型，開發出具有高重復性、穩定性及能夠模擬腱病不同病理時期的物理致病模型很有必要。現有研究結果顯示沒有有效的動物模型能夠模擬人類的所有腱病，繼續建立各個解剖部位腱病動物模型是很有必要的。在腱病的病理化改變和特點上，跑臺模型與膠原酶注射模型具有相似性。腱病為多因素導致肌腱結構功能的累進式紊亂，單一動物模型無法滿足腱病各個方面的研究，只能用于研究腱病某一特定的方面。物理腱病模型通常更加適用于對慢性機械負荷導致肌腱紊亂的研究，而化學腱病模型更加適用于有缺陷的愈合過程的研究。為了更好地理解腱病的發病機制，開發新的動物模型，進一步提高造模的可重復性和成功率是今后的研究方向。