免疫學因素在原因不明復發性自然流產發病機制中的研究進展

賈麗媛，奚永志，孫玉英

1安徽醫科大學307臨床學院，北京 100071；2解放軍總醫院第五醫學中心 免疫學實驗室，北京 100071

原因不明復發性自然流產(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)是指與同一配偶連續發生3次或3次以上的自然流產(孕齡小于12周)，并排除已知病因，如遺傳背景異常、內分泌失調、生殖系統感染、生殖器官畸形、自身免疫疾病以及凝血功能異常等，占妊娠總數的1% ～ 5%[1]。URSA發病機制尚不明確，但是既往研究發現其多與免疫學因素有關[2]。由于胚胎及滋養細胞有來自父系的遺傳物質，妊娠類似于同種異體移植。正常妊娠中，母體免疫系統對半相合同種異體胚胎產生的特異性免疫抑制物(封閉抗體、dNK細胞等)以及免疫激活物(如輔助性T細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞、補體等)共同構成免疫耐受平衡系統，形成母體對胚胎免疫耐受的平衡狀態[3]。URSA是妊娠母體中母胎免疫耐受平衡狀態被打破而造成母體對胚胎免疫排斥的結果。近年研究表明，固有免疫系統和獲得性免疫系統中關鍵細胞及其細胞因子異常均會造成母體與胎兒間免疫耐受失衡而產生免疫排斥，并致流產的發生[4-5]。因此，本文就固有免疫系統與獲得性免疫系統中關鍵分子異常對URSA發病機制影響的研究進展做如下綜述。

1 固有免疫系統

1.1 自然殺傷細胞 自然殺傷(natural killer，NK)細胞是機體的固有免疫細胞，在非妊娠健康人體內主要存在于外周血液循環中。外周血NK(peripheral NK，pNK)細胞主要是CD56dimCD16+NK細胞，無需主要組織相容性復合體特異性限制即可激活抗體依賴的細胞毒反應，對抗腫瘤和感染。Muyayalo等[6]最早發現URSA患者外周血pNK細胞水平明顯上升，表明URSA的發生與pNK細胞介導的細胞毒作用增強有一定關系，也可能由NK細胞分泌過多殺傷因子而導致胚胎種植失敗。Seshadri和Sunkara[7]的Meta分析也顯示，URSA患者的pNK細胞水平明顯高于健康妊娠者。因此，對于有URSA病史的患者，pNK細胞數量的提升可能預示著隨后的流產。此外，pNK細胞產生的促炎和抗炎因子在有反復流產史的女性中也存在代謝紊亂的情況，但其潛在的分子機制尚不清楚，需要進一步的研究加以闡明[8]。

蛻膜NK(decidua NK，dNK)細胞多為CD56+CD16-NK細胞，占子宮淋巴細胞比例最多(70% ～90%)，主要存在于子宮內膜和蛻膜中。dNK細胞膜表面表達多種抑制性受體(NKG2C、NKG2E和KIR)和激活性受體(NKp30、NKp40和NKp46)。正常妊娠過程中，占優勢的是dNK抑制性受體，抑制其發揮細胞毒性，保護胚胎發育[9]。如果dNK激活性受體異常表達，激活dNK細胞發揮殺傷活性，殺傷胚胎細胞導致流產[9-10]。Wang等[11]檢測URSA蛻膜dNK細胞中KIR表達水平，發現KIR2DL1/S1在CD56+CD16-NK細胞中的表達明顯低于對照組(P=0.026)，并推測抑制性受體KIR的特異性表達降低可能是URSA發生胚胎丟失的免疫機制。

研究表明，蛻膜dNK細胞明顯增高與URSA發生相關。Kuon等[12]用免疫組化方法評估URSA的dNK細胞數量水平，發現URSA的dNK細胞明顯高于正常對照組(P=0.04)。研究還發現，外周血淋巴細胞CD45+CD3-DR+(P＜0.01)和CD45+CD3+CD8+DR+(P=0.04)的數目越高，dNK細胞數也越高，其高相關性提示激活的成熟免疫細胞可能為dNK細胞的分化提供細胞因子。同時，Toth等[13]研究發現，與原發性URSA(無既往活產史)相比，繼發性URSA組(有既往活產史)的dNK細胞數量水平較高(P=0.044)，而pNK細胞水平較低。由此可見，原發性和繼發性URSA的NK細胞水平也存在差異，需要深入探究以闡明pNK和dNK細胞的數量與功能變化在URSA發病中的作用。

近些年不少研究者提議，根據dNK細胞的數量水平可將URSA分為低、正常和高dNK細胞水平組[14]。通過對不同dNK細胞水平的URSA患者妊娠結果隨訪，探究其與URSA風險的關系。但是，目前對于正常妊娠母體的dNK細胞的正常值范圍并沒有明確的臨界值，不同研究對于高水平dNK細胞的判斷標準也不盡相同。Quenby等[15]將dNK細胞占蛻膜細胞的5%定義為危險臨界值，超過該值將易導致URSA的發生；而Teklenburg等[16]將易發生URSA的dNK細胞比例界定為12.9%。因此，對于URSA患者的dNK細胞數量水平的范圍界定尚需大量病例對照研究和質量控制標準化。

1.2 巨噬細胞 巨噬細胞可通過識別病原體產生大量的細胞因子和趨化因子，并將病原體加工并呈遞給CD4+T細胞，從而將固有與適應性免疫系統聯系起來。作為正常妊娠過程中最主要的抗原提呈細胞之一，其細胞功能或所分泌細胞因子的改變均會影響母胎界面免疫耐受平衡狀態的維持[17]。對于不同的外界刺激，巨噬細胞可以分化為M1和M2兩型。M1型是有抗原提呈功能的促炎性反應細胞，可分泌大量促炎性細胞因子，如TNF-α等[18]；M2型具有誘導免疫耐受特性，分泌抗炎性細胞因子IL-10，在抑制寄生蟲、組織重建和免疫調節功能中發揮重要作用[19-20]。已有研究表明，URSA母胎界面的巨噬細胞數量增加，并且多伴隨高水平炎性因子和抗腫瘤活性的M1激活[21-22]。Wang等[23]認為，M1型巨噬細胞異?；罨虸L-10表達水平降低是由Treg細胞通過細胞間接觸和分泌TGF-β介導的機制引起的。Kolben等[21]認為是M1型巨噬細胞激活現象與過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAPγ)表達受到抑制有關，PPAPγ表達升高可減輕母胎界面炎癥反應。Goto等[24]認為URSA與巨噬細胞中組織蛋白酶E(CatE)有關，URSA患者蛻膜巨噬細胞產生的組織蛋白酶E活性顯著下降。同時，URSA小鼠模型也顯示CatE(-/-)小鼠雖可生育，但產仔數顯著減少[24]。由此可見，在URSA發病機制中巨噬細胞的作用不可忽視。

1.3 樹突狀細胞 樹突狀細胞(dendritic cell，DC)作為啟動和調控適應性免疫的始動環節，是目前已知功能最強的抗原提呈細胞。研究發現其不僅能夠活化機體免疫應答抵抗外來微生物入侵，在妊娠過程誘導免疫耐受中也發揮重要作用，其介導的耐受機制主要體現在誘導T細胞的免疫耐受。DC通過誘導T細胞無能、介導T細胞克隆清除、調節T細胞亞群分化及誘導調節性Treg產生等機制而產生T細胞無反應性。如果DC亞群及其功能異常，通過刺激T細胞增殖分化，激活炎癥免疫反應而攻擊胚胎，這可能是導致URSA發生的機制之一[25]。

DC細胞根據其分化程度分為非成熟DC(iDC)和成熟DC(mDC)。mDC高表達共刺激信號(如CD80/CD86、CD40、 細 胞 間 黏 附 分 子 1)和MHC-Ⅱ類分子；而iDC僅低表達MHC-Ⅱ類分子，不表達或低表達共刺激分子。Qian等[26]采用免疫組化染色技術發現，在30個隨機選擇的高倍視野(HPF)中，URSA患者蛻膜組中mDC比例(14.20±13.34/30 HPF)顯著高于正常早孕婦女(4.77±2.64/30 HPF，P=0.001)。Huang等[27]通過流式細胞術進一步佐證mDC數量的增加與URSA顯著相關(OR：1.14，95% CI，1.01 ～ 1.29，P＜ 0.05)。 當 DC 細胞向T細胞提呈抗原時，DC表面的CD80/CD86與T細胞膜上CD28結合，作為T細胞激活的第二信號協同刺激T細胞活化和分化。Jin等[28]在URSA流產模型小鼠孕第4天植入抗CD80和抗CD86單克隆抗體，發現孕鼠外周血Th1型細胞因子分泌顯著減少，小鼠胚胎丟失率(8.64%)明顯低于對照組(26.67%)，表明DC細胞膜的CD80/CD86表達水平與母胎界面的免疫耐受程度呈負相關，不利于胚胎發育。

免疫球蛋白樣轉錄物4(immunoglobulin-like transcript 4，ILT4)是免疫球蛋白(Ig)基因超家族的成員之一，在DC細胞中與HLA-G相互作用可以啟動與免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)相關的細胞內信號傳導的級聯反應。ILT4可通過ITIM誘導SHP-1磷酸酶去磷酸化和NF-κB鈣依賴性下調，隨后導致共刺激分子CD80和CD86在DC中的表達降低。Liu等[29]研究發現反復流產組女性外周血和子宮內膜中的ILT4+DC減少，并猜測ILT4+DC是通過誘導Foxp3+Treg細胞在維持免疫耐受中發揮作用；而子宮內膜ILT4與Foxp3表達之間存在密切關系[30]。由此可見，DC的功能改變與免疫耐受失衡密切相關，DC亞群變化及表面功能分子表達差異可能是URSA發病機制之一。

1.4 補體 補體具有酶活性，是連接固有免疫和適應性免疫的橋梁，其廣泛存在于機體血液、組織、妊娠母胎界面，在機體的防御功能、調節免疫系統功能以及免疫病理中發揮重要作用。正常妊娠過程中，一定程度的補體成分激活對胎兒及妊娠附屬物的正常發育是必需的，如滋養層一定水平的補體有助于胎盤對病原體的免疫防御、滋養細胞遷移和新血管生成[31-32]。Huang等[33]通過對子宮內膜基因的表達分析發現，補體級聯通路在URSA中顯著下調。與正常組相比，URSA患者子宮內膜的補體C3、C4、C4BP、DAF、DF、SERPING1表達水平顯著下降。也有研究認為，URSA患者蛻膜組織中存在補體異常激活，蛻膜中高水平補體能與募集的中性粒細胞和單核細胞表面結合，激活細胞炎癥通路，引起胚胎組織炎癥、缺血以及壞死。Ohmura等[34]認為URSA患者體內存在高滴度水平的抗C1q抗體，激活了母胎界面的補體經典激活途徑，從而導致胎盤損傷和胚胎丟失。C4d是補體激活經典途徑的非功能性分裂產物，其附著于細胞和組織，在移植、妊娠、自身免疫等疾病中被認為是同種異體排斥反應的潛在生物標記物[35]。Meuleman等[36]研究發現，與散發性流產和人工流產的女性相比，URSA婦女合體滋養細胞的C4d沉積顯著增加，導致胚胎丟失的原因是由于蛻膜補體過度激活。由此可見，補體含量過低或異常激活對妊娠都是不利的，補體活化和補體抑制因子的動態平衡是成功妊娠的必要條件。補體系統由于其復雜的級聯反應常被研究者回避，但URSA患者體內的補體異常激活反應，為妊娠失敗提供了治療新靶點。因此，對于補體與URSA之間的關聯性還需進一步研究與發掘。

2 獲得性免疫系統

2.1 封閉因子 正常妊娠中，父系淋巴細胞表面抗原可刺激母體產生稱為封閉抗體(blocking antibody，BA)的相應抗體并與胚胎滋養細胞的父系抗原形成封閉，保護胚胎免受母體滋養層免疫細胞的損傷。目前臨床多認為URSA的發生與患者缺乏BA有關。若妊娠時母體缺乏足夠的BA，可引起母體同種免疫識別保護功能低下，易對胎兒發生異物排斥反應，從而造成流產。國內外研究發現，對缺乏BA的復發性流產患者應用同種異體淋巴細胞免疫治療(lymphocyte immunology therapy，LIT)可以誘導封閉抗體陽性率顯著提高，再次妊娠的成功率可達89.7%，顯著高于未治療的URSA患者[37-38]。對于URSA患者封閉抗體水平的評估，Yuan等[39]通過單向混合淋巴細胞反應封閉效率實驗(MLC-BE)來評價BA陽性率，發現MLC-BE陽性率在LIT治療后(58.1%)明顯高于治療前(16.2%)，特異性封閉抗體(anti-idio blocking antibody，BEAb2)陽性率從11.1%提升到47%，而且治療后妊娠成功率達到73.5%。這說明異基因淋巴細胞主動免疫治療能顯著提高URSA患者體內BA陽性率以及妊娠成功率。

群體反應性抗體(panel reactive antibodies，PRA)是血清中一類專門針對人類白細胞抗原(HLA)的封閉抗體，任興斌和張偉[40]用酶聯免疫方法檢測URSA患者經主動免疫治療前后PRA的變化，發現URSA患者經免疫治療后妊娠組血清PRA陽性率較免疫治療后未孕組明顯提高(P＜0.01)。這提示URSA患者經主動免疫治療后，在提升自身免疫耐受和免疫抑制功能的同時，產生了針對其配偶HLA抗原的封閉抗體，抑制了URSA患者對其胚胎父系抗原的處理和提呈。因此，PRA下調了免疫應答強度，對抑制URSA的發生及后續的妊娠成功起到了重要作用。所以，對原因不明復發性自然流產患者應及早篩查PRA，并在主動免疫治療后及時檢測PRA的變化，觀察患者機體免疫耐受狀態，為治療贏得最佳時機，并有效提升治療成功率。

2.2 CD4+T細胞亞群及其細胞因子 在不同細胞因子誘導刺激下，初始CD4+T細胞可分化為Th1、Th2、Th17以及Treg等成熟淋巴細胞。研究發現Th1、Th2、Th17、Treg細胞及其分泌因子均參與母胎免疫耐受調節。Th1細胞分泌IL-2等促炎性細胞因子，介導和調控機體炎癥效應，對滋養層細胞產生細胞毒性。Th2細胞分泌IL-4等促進抗體生成的細胞因子，增強抗體介導的體液免疫應答，促進免疫耐受狀態的形成。因此母體對胎兒的識別及妊娠的維持主要通過占優勢的Th2型細胞因子來實現。正常妊娠中，Th1細胞和Th2細胞通過細胞因子和細胞間信號傳導進行交互作用，處于相對平衡狀態。Liu等[41]通過流式細胞技術對臨床治療有效組和未治療組URSA患者外周血細胞因子水平進行檢測顯示，有效治療組外周血Th1/Th2細胞比例水平顯著低于未治療組。說明經過免疫治療后，URSA患者體內炎癥免疫反應降低，免疫耐受機制增強。這進一步說明妊娠的成功依賴于母體Th1/Th2細胞的平衡。

同時，大量研究表明Th17/Treg細胞平衡也與URSA的發病機制有關。Th17細胞表達IL-17、IL-17A、IL-22等，其中IL-17可誘導分泌多種炎性細胞因子(如集落刺激因子G-CSF、巨噬細胞炎性蛋白MIP-2、單核細胞趨化蛋白MCP-1、IL-8)，召集中性粒細胞浸潤而損傷胚胎。Treg細胞通過分泌TGF-β、IL-10，特異性表達FoxP3，抑制CD4+和CD8+T細胞增殖和效應功能，阻止炎癥反應，維持免疫耐受。羅娜等[42]通過流式細胞技術發現，與早孕組和未孕組相比，URSA組的Th17和Th17/Treg水平顯著上升，Treg細胞含量明顯降低(P均＜0.01)。Ahmadi等[43]發現，經有效治療后的URSA患者外周血Th17細胞比例和功能顯著下降，Treg細胞呈上升趨勢；Th17細胞介導的炎癥反應下降，Treg細胞發揮抑制免疫排斥作用增強，趨向母胎免疫耐受狀態。

Roomandeh等[44]通過ELISA方法檢測URSA外周血中IL-17、IL-17A、IL-22、TGF-β、IL-10表達水平發現，URSA外周血中Th17細胞分泌促炎因子IL-17、IL-17A、IL-22的血清濃度明顯高于正常妊娠組(P＜0.001，P=0.01，P＜0.001)，Treg細胞分泌TGF-β水平降低(P=0.02)，Th17和Treg細胞的功能性改變進一步驗證了Th17/Treg偏移可能導致URSA的反復自然流產。Zenclussen[45]通過對自然流產模型孕鼠注射體外擴增的經妊娠誘導的CD4+CD25+Treg細胞發現，孕鼠胚胎丟失率明顯減少，說明Treg細胞在維持妊娠中發揮重要作用且必不可少。以上研究均提示，Th1、Th2、Th17、Treg細胞及其細胞因子對母體維持妊娠是十分重要的。臨床上可進行檢測外周血或蛻膜中輔助性T細胞亞群變化，以判斷子宮免疫系統和免疫耐受微環境是否異常，作為預測流產發生的危險因素。

3 結語

固有免疫系統與獲得性免疫系統中關鍵分子異常對URSA發病機制影響的研究已經取得了較大的進展，但仍存在一些相互矛盾的結論以及待闡明的問題。為形成一個科學、系統的URSA發病理論體系，尚需在如下方面對研究進行嚴格的規范：1)應確定URSA的篩查標準，如流產次數、孕齡、是否為同一配偶以及排除其他非同種異體免疫學因素等，以提高研究對象的同質性。2)采用先進的科學分析技術，如基因組學，轉錄組學以及蛋白組學等技術，精準研究URSA的發病機制，精確定位URSA的診療靶標。3)要多中心廣泛聯合研究，結合大樣本大數據，以期最終揭示免疫學因素在URSA發病機制中的重要作用。通過以上研究，最終形成科學系統的URSA發病理論體系，為該病的特異高效診療提供堅實的實驗及理論基礎以及新靶標和新途徑。