環(huán)狀RNA 調(diào)控干細(xì)胞參與骨再生的研究進(jìn)展

梁甲武，朱 恒，胡 巍，屈 爽，郭 斌

1 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京 100853 ；2 軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

腫瘤、炎癥、創(chuàng)傷及發(fā)育畸形是導(dǎo)致骨缺損的四大主要因素。骨缺損嚴(yán)重影響患者的外觀及運(yùn)動(dòng)、咀嚼等重要功能。近年來的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)表明，組織工程骨有望成為一種理想的修復(fù)材料，重建患者骨缺損區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能。干細(xì)胞是一大類具有多向分化及自我更新能力的細(xì)胞，多種干細(xì)胞被用于骨組織工程。目前研究用于骨修復(fù)的干細(xì)胞主要有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 及 牙 周 膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs) 等組織特異性干細(xì)胞。不同的干細(xì)胞骨再生效果存在差異，可能與各種干細(xì)胞調(diào)控機(jī)制不同有關(guān)。因此，深入研究干細(xì)胞成骨進(jìn)程中相關(guān)調(diào)控機(jī)制，有望進(jìn)一步發(fā)揮骨組織工程的優(yōu)勢(shì)，達(dá)到更加理想的骨缺損修復(fù)效果。

環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs) 是一類反向剪接形成的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA[1]。最初circRNAs 發(fā)現(xiàn)于植物類病毒中，曾經(jīng)一度被認(rèn)為是錯(cuò)誤剪接的產(chǎn)物。隨著RNA 測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的高速發(fā)展，研究人員不但發(fā)現(xiàn)存在于多種生物體內(nèi)的成千上萬種circRNAs，而且不斷認(rèn)識(shí)到circRNAs 在組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育、疾病的發(fā)生發(fā)展方面發(fā)揮重要作用。相關(guān)結(jié)果表明，不同微環(huán)境中的干細(xì)胞circRNAs 表達(dá)存在差異，且circRNAs 的差異表達(dá)影響各類干細(xì)胞的生物學(xué)特性，如干細(xì)胞的干性維持、誘導(dǎo)分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞自我更新等，進(jìn)而影響干細(xì)胞的成骨進(jìn)程。本綜述重點(diǎn)關(guān)注circRNAs 調(diào)控微小RNA(microRNAs，miRNAs) 的海綿功能，力求深入認(rèn)識(shí)circRNAs 在干細(xì)胞成骨過程的表達(dá)變化及調(diào)控機(jī)制的研究現(xiàn)狀，并闡明現(xiàn)有研究工作的局限性，為進(jìn)一步優(yōu)化基于干細(xì)胞的骨再生提供新思路。

1 circRNAs 概述

1.1 circRNAs 生物發(fā)生、分類及特點(diǎn) circRNAs主要由真核生物蛋白質(zhì)編碼基因的前體RNA(premRNA) 通過可變剪切加工產(chǎn)生。與線性RNA 不同，circRNAs 不具有5’末端帽子和3’末端poly(A) 尾，通過外顯子環(huán)化或內(nèi)含子環(huán)化形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)[1]。雖然在多數(shù)真核生物中，circRNAs 是由剪接體產(chǎn)生，但酵母、植物和動(dòng)物的具體機(jī)制似乎不同[2-3]。關(guān)于circRNAs 的具體生物合成機(jī)制也一直在探索中。近期，Li 等[4]通過冷凍電鏡解析了酵母剪切體E 復(fù)合體結(jié)構(gòu)，并基于該結(jié)構(gòu)分析了長(zhǎng)外顯子circRNAs 的形成機(jī)制：外顯子足夠長(zhǎng)的情況下，EDC 復(fù)合體可以介導(dǎo)pre-mRNA 內(nèi)部反向剪切，最終形成circRNAs。此外，研究發(fā)現(xiàn)circRNAs 的形成過程除受到順式( 內(nèi)含子互補(bǔ)序列) 和( 或)反式因子( 剪接因子) 的嚴(yán)格調(diào)控外，還受諸多蛋白、分子以及基因體的表觀遺傳變化等因素影響。 circRNAs 根據(jù)序列來源分為外顯子環(huán)狀RNA(exon circRNA，EcircRNA)、內(nèi)含子環(huán)狀RNA(circular intronic RNA，CiRNA) 以及外顯子- 內(nèi)含子環(huán)狀RNA(exon-intron circRNA，EIcircRNA)。絕大多數(shù)circRNAs 屬于EcircRNA。此外，circRNAs具有以下特點(diǎn)：1) 哺乳動(dòng)物中circRNAs 的表達(dá)具有高度保守性和組織特異性[5]；2)circRNAs 具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶降解，因而比線性RNA 更穩(wěn)定，半衰期更長(zhǎng)[6]；3)circRNAs 整體表達(dá)豐度低于mRNA。對(duì)于大多數(shù)同時(shí)含有線性和環(huán)狀RNA 的基因，circRNAs 的數(shù)量為線性數(shù)量的0.1% ～ 10%，大多數(shù)小于1%[7]。但據(jù)Jeck 等[8]報(bào)道，至少有50 個(gè)基因的circRNAs 豐度比線性RNA 更高。

1.2 circRNAs 的生物學(xué)功能

1.2.1 miRNAs 海綿作用 近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)某些circRNAs 分子通過表面的miRNA 反應(yīng)原件(miRNA response elements，MREs) 選擇 性吸附miRNAs，降低miRNAs 的表達(dá)水平，進(jìn)而解除其對(duì)下游靶mRNA 的抑制，調(diào)控下游靶基因表達(dá)。這種作用機(jī)制被稱為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA) 機(jī)制，又稱海綿機(jī)制。如circCAMSAP1 作為miR-328-5p 的海綿，阻斷了miR-328-5p 對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F1 的抑制，促進(jìn)了大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，預(yù)測(cè)circCAMSAP1 可作為大腸癌的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物以及潛在的治療靶點(diǎn)[9]；此外，Li 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Circ-0002483 可結(jié)合多個(gè)miRNA，包括miR182-5p、miR-520q-3p、miR-582-3p、miR-587 和miR-655。 其 中Circ-0002483 通 過 對(duì)miR-182-5p 的海綿作用，調(diào)控miR-182-5p 的靶基因GRB2、FOXO1 和FOXO3 的表達(dá)，從而抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展，并增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感度。

1.2.2 與RNA 結(jié)合蛋白相互作用 RNA 結(jié)合蛋白(RNA binding proteins，RBPs) 在RNAs 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、參與組織發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展。以往研究表明，RBPs 在多種組織中均有表達(dá)，但某些RBPs 具有組織特異性或僅在病理?xiàng)l件下產(chǎn)生，可作為疾病的生物標(biāo)志物[11]。Abdelmohsen 等[12]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circPABPN1 可以抑制Hur 與PABPN1 mRNA 的結(jié)合，而PABPN1 mRNA 多聚體分析發(fā)現(xiàn)，PABPN1的翻譯受Hur 正向調(diào)控和circPABPN1 負(fù)向調(diào)控。因此，circPABPN1 與Hur 結(jié)合阻止了Hur 與PABPN1 mRNA 的結(jié)合，并降低了PABPN1 的翻譯水平。最新研究報(bào)道，circSKA3 可促進(jìn)TKS5 定位至細(xì)胞膜，與Integrin β1 相互作用，促進(jìn)侵襲性偽足的形成，從而促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[13]。

1.2.3 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄 據(jù)目前研究，位于細(xì)胞核內(nèi)的某些ciRNAs 和EIcircRNAs 具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。Kwek 等[14]發(fā)現(xiàn)，每個(gè)EIcircRNAs 在保留的內(nèi)含子中都有一個(gè)U1 snRNA 結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)可通過Pol Ⅱ促進(jìn)磷酸二酯鍵的形成。Li 等[15]發(fā)現(xiàn)circPAIP2 和circEIF3J 與U1 snRNA 相互作用，可促進(jìn)其親本基因轉(zhuǎn)錄。也有研究發(fā)現(xiàn)，ciRNA 在轉(zhuǎn)錄伸長(zhǎng)階段控制轉(zhuǎn)錄。ci-ankrd52 特異地合成反義寡核苷酸(synthetic antisense oligodeoxynucleotides，ASO) 與ankrd52 的pre-mRNA 內(nèi) 含 子 互 補(bǔ)， 可能與pre-mRNA 結(jié)合，并降解pre-mRNA，導(dǎo)致mRNA 水平下降。此外，ASO 介導(dǎo)的ci-MCM5 和ci-SIRT7 的敲除也得到了類似的結(jié)果[16]。最新研究發(fā)現(xiàn)，circSamd4可通過抑制PURA和PURB蛋白，從而減輕PUR 蛋白對(duì)MHC 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄抑制作用，間接促進(jìn)肌源性分化[17]。

1.2.4 參與蛋白質(zhì)翻譯 circRNAs 除具有miRNAs海綿和調(diào)控RBP 等非編碼功能外，某些circRNAs還可編碼。但由于circRNAs 不含5' 帽子結(jié)構(gòu)，翻譯circRNAs 通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，以帽子獨(dú)立的方式翻譯。Zhang 等[18]發(fā)現(xiàn)位于起始密碼子下游的IRES，能夠驅(qū)動(dòng)circSHPRH 的翻譯啟動(dòng)。circSHPRH 產(chǎn)生一種新的蛋白質(zhì)SHPRH-146aa，并可被質(zhì)譜檢測(cè)，SHPRH-146aa 可保護(hù)相關(guān)的全長(zhǎng)SHPRH 蛋白質(zhì)不被降解，抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞增殖和致瘤性。此外，circ-AKT3 通過重疊的起始- 終止密碼子UAAUGA 編碼174-aa蛋白，即AKT3-174aa。AKT3-174aa 過表達(dá)可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，輻射抗性和致瘤性[19]。

2 circRNAs 參與干細(xì)胞骨再生過程

2.1 circRNAs 調(diào)控干細(xì)胞成骨分化 Zhang 等[20]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)BMSCs 成骨分化過程中的circRNAs 表達(dá)譜存在差異。與成骨分化第0 天(D0) 相 比， 第7 天(D7) 的BMSCs 上 調(diào) 了3 938 個(gè)circRNAs，下調(diào)了1 505 個(gè)circRNAs。Della Bella[21]利用RNA 雜交陣列對(duì)BMSCs 成骨分化過程中差異表達(dá)的circRNAs 進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，與對(duì)照組(D0) 相比，成骨分化組(D7) 有21 個(gè)表達(dá)上調(diào)的circRNAs 和21 個(gè)表達(dá)下調(diào)的circRNAs。此外，Ouyang 等[22]發(fā)現(xiàn)骨不連患者的BMSCs 中circ-0074834 表達(dá)降低，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circ-0074834可結(jié)合miRNA-942-5p， 而后者通過靶向調(diào)控ZEB1 和VEGF 的表達(dá)，抑制BMSCs 的成骨分化，這提示circ-0074834 可能作為miRNA-942-5p 的海綿促進(jìn)BMSCs 的成骨分化及骨缺損修復(fù)。

此外，Peng 等[23]從正常和BMP2 誘導(dǎo)的上頜竇膜干細(xì)胞(maxillary sinus membrane stem cells，MSMSCs) 成骨分化過程中circRNAs 的差異表達(dá)譜中篩選出可能影響MSMSCs 成骨分化的circRNA—circRNA-33287。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-33287的過表達(dá)/ 敲低，升高/ 降低了成骨的關(guān)鍵標(biāo)志Runx2、Osx/ALP 的 表 達(dá) 水 平。circRNA-33287吸附miR-214-3p，靶向其3' 端非編碼區(qū)來調(diào)控Runx3 的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，circRNA-33287 可促進(jìn)異位骨形成，并且與miR-214-3p 抑制劑共轉(zhuǎn)染時(shí)刺激骨形成的能力最強(qiáng)。因此，circRNA-33287 作為miR-214-3p 的分子海綿，靶向上調(diào)Runx3 表達(dá)，從而促進(jìn)MSMSCs 成骨分化。

另有研究發(fā)現(xiàn)，CDR1as 對(duì)PDLSCs 成骨分化具有調(diào)節(jié)作用[24]。Li 等[24]研究發(fā)現(xiàn)CDR1as 在PDLSCs 成骨分化過程中顯著上調(diào)，而miR-7 水平下調(diào)。CDR1as 的敲除和miR-7 的過表達(dá)可抑制ALP 活性及成骨基因的表達(dá)，降低Smad1/5/8和p38MAPK 的磷酸化水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CDR1as 敲除組骨修復(fù)效果明顯不如對(duì)照組。因此認(rèn)為，CDR1as 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-7，上調(diào)Smad1/5/8和p38MAPK 磷酸化水平， 從而促進(jìn)PDLSCs 的成骨分化。 此外，Chen 等[25]發(fā)現(xiàn)CDR1as 基因敲除促進(jìn)BMSCs 成骨分化、抑制成脂分化，過表達(dá)CDR1as 則導(dǎo)致BMSCs 成骨分化減少、成脂分化增加。后通過熒光素酶報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)，CDR1as 通過靶向miR-7-5p/Wnt 5B 軸促進(jìn)BMSCs的成脂分化，抑制成骨分化。綜上所述，同一種circRNAs 在不同干細(xì)胞，或干細(xì)胞的不同分化階段可能存在差異表達(dá)，甚至可能發(fā)揮截然相反的作用。需深入發(fā)掘其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，才有望讓其成為調(diào)控頜骨再生“利器”。

2.2 circRNAs 調(diào) 控 干 細(xì) 胞 增 殖 Wang 等[26]研究發(fā)現(xiàn)， 在LPS 誘導(dǎo)的炎癥條件下，PDLSCs中CDR1as 的表達(dá)水平明顯低于正常PDLSCs，PDLSCs 的增殖能力亦低于正常PDLSCs。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于LPS 處理后的PDLSCs，過表達(dá)miR-7 可抑制PDLSCs 增殖，敲除miR-7 則促進(jìn)PDLSCs 增殖；而過表達(dá)CDR1as 可減輕LPS 誘導(dǎo)的PDLSCs 增殖抑制，敲除CDR1as 則會(huì)增強(qiáng)抑制作用。根據(jù)之前已有報(bào)道，CDR1as 可作為miR-7海綿發(fā)揮生物學(xué)功能，miR-7 可通過靶向ERK 信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖。因此認(rèn)為，CDR1as 作為miR-7 海綿，激活ERK 信號(hào)通路，促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)炎癥條件下的PDLSCs 增殖。此外，Ren 等[27]將經(jīng)或不經(jīng)降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP) 刺激的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的RNA 用于微陣列檢測(cè)circRNAs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CGRP 刺激小鼠BMSCs 前后有58個(gè)circRNAs 顯著差異表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默mmu-circRNA-003795 可以上調(diào)miR-504-3p的表達(dá)，而后者可靶向結(jié)合FOSL2 抑制細(xì)胞增殖。此外，使用miR 抑制劑沉默miR-504-3p 可上調(diào)FOSL2。因此，mmu-circRNA-003795 通過對(duì)miR-504-3p 的海綿作用，間接調(diào)節(jié)FOSL2 mRNA的表達(dá)，促進(jìn)BMSCs 增殖。

此外，與上述circRNAs 促進(jìn)細(xì)胞增殖不同，有研究發(fā)現(xiàn)某些circRNAs 可抑制干細(xì)胞增殖。Kuang 等[28]研究發(fā)現(xiàn)與未患激素性股骨頭壞死(GIONFH) 的患者相比，GIONFH 患者circUSP45的表達(dá)增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circUSP45降低了成骨基因的表達(dá)，抑制BMSCs 增殖。此外，circUSP45 主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，并與miR-127-5p 直接相互作用。miR-127-5p 與其靶點(diǎn)PTEN 共同作用于BMSC 成骨調(diào)控。因此，circUSP45 通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-127-5p，調(diào)控PTEN/AKT 信號(hào)通路，抑制BMSCs 增殖及成骨進(jìn)程。

2.3 circRNAs 調(diào)控干細(xì)胞自我更新 干細(xì)胞的自我更新是一個(gè)由多種外源性細(xì)胞因子和內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用的非常復(fù)雜的調(diào)控過程。前期研 究 發(fā) 現(xiàn)MEK/ERK、PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和JAK/STAT 等信號(hào)通路對(duì)干細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控具有重要意義，但circRNAs 在這一過程中的作用仍尚不明確[29]。Cherubini 等[30]近期研究發(fā)現(xiàn)，circFOXP1 海 綿 吸 附miR-17-3p 和miR-127-5p，通過表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR) 和非典型Wnt 信號(hào)通路調(diào)節(jié)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs) 生長(zhǎng)和分化之間的平衡，并提出控制干細(xì)胞自我更新與分化之間的平衡是維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。這提示了circFOXP1 可能通過EGFR 和非典型Wnt 信號(hào)通路調(diào)節(jié)iPSCs 自我更新和分化，進(jìn)而促進(jìn)骨再生。此外，早期有研究報(bào)道，miR-145 過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞(HESCs) 自我更新能力降低[31]，而miR-145 會(huì)受到circRNA-00156 的海綿抑制，調(diào)控下游靶基因表達(dá)[32]，因此推測(cè)某些circRNAs 可能潛在影響成骨干細(xì)胞的自我更新，但目前尚未發(fā)現(xiàn)。綜上所述，circRNAs 可能在成骨干細(xì)胞自我更新中發(fā)揮著重要作用，具體相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

2.4 circRNAs 調(diào)控成骨細(xì)胞的功能 在頜骨再生過程中，成骨干細(xì)胞終將分化為成骨細(xì)胞進(jìn)行骨缺損區(qū)修復(fù)。因此，circRNAs 對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)控成為影響骨再生效果的又一重要因素。Mi等[33] 發(fā)現(xiàn)骨折愈合過程中PIK3R1 的表達(dá)增加與MC3T3-E1 細(xì)胞增殖增強(qiáng)和凋亡減少直接相關(guān)。此外，miR-7223-5p 靶向PI3KR1，在促進(jìn)凋亡的同時(shí) 抑 制MC3T3-E1 的 增 殖。 而circRNA AFF4 作為miR-7223-5p 的海綿，促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。股骨骨折處局部注射circRNA AFF4 可促進(jìn)骨折愈合，而注射miR-7223-5p 則阻礙骨折愈合。這些發(fā)現(xiàn)提示circRNA AFF4 通過靶向miR-7223-5p/PIK3R1 軸促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和抑制凋亡，進(jìn)而促進(jìn)骨修復(fù)。此外，BMP2 可通過Circ-19142/Circ-5846 靶 向miR-7067-5p 促 進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，且與參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的FGF、EGF、PDGF 和Wnt 信號(hào)通路密切相關(guān)[34]。

3 小結(jié)與展望

全面認(rèn)識(shí)干細(xì)胞成骨的調(diào)控機(jī)制有助于優(yōu)化以干細(xì)胞為核心的骨再生策略，提升骨再生的安全性和有效性。隨著新一代測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的高速發(fā)展，circRNAs 的生物發(fā)生機(jī)制和生物學(xué)功能得到了深層次的發(fā)掘。circRNAs 在干細(xì)胞介導(dǎo)的骨再生領(lǐng)域的作用仍有廣闊的探索空間。相關(guān)工作將對(duì)推動(dòng)骨組織工程發(fā)展，促進(jìn)干細(xì)胞在骨再生中的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)支持。