海洋細菌基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜鑒定數據庫的建立

李艷君，丁毅偉，趙強元，馬 聰

解放軍總醫院第六醫學中心 檢驗科，北京 100048

海洋細菌廣泛分布于海洋環境中，可通過多種途徑引發嚴重感染，如食用污染海產品引發的細菌性食物中毒、海水浸泡引發的傷口感染等[1-3]。從軍事角度來看，戰傷合并海水浸泡可能引起傷口細菌感染，給傷員救治帶來一定難度，病原菌的快速鑒定對于感染的診治至關重要。近年來基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS) 突破傳統方法鑒定耗時長、鑒定能力不足等弊端，在臨床得以廣泛應用[4-7]。然而，在實際應用中我們發現，對于海洋細菌這一類特殊群體，MALDI-TOF MS 存在鑒定能力不足的問題，其主要的原因是儀器商品化的數據庫包含的海洋細菌菌種資源較少，缺少可供鑒定比對的數據。本研究通過收集海洋環境來源細菌，建立本地化海洋細菌MALDI-TOF MS 鑒定數據庫，目的在于提高海洋細菌的鑒定能力，從而為海洋細菌引起的各類感染性疾病的快速診斷和治療提供幫助。

材料與方法

1 樣本來源 本中心課題組選取2006 - 2016 年分離保存的國內外6 大海域158 個采樣點海洋細菌530 株( 表1)，其中430 株用于構建數據庫，100 株用于驗證數據庫鑒定能力。所有凍存菌株甘油保存液復溫后以三區劃線方式接種至哥倫比亞血瓊脂培養基，35℃培養24 h，獲得純培養細菌菌落。

表1 用于自建庫海洋細菌來源信息Tab. 1 Source information of marine bacteria for in-house database construction

2 儀器與試劑 德國Bruker 公司的Microflex 系列MALDI-TOF 質譜儀及配套分析軟件FlexControl 3.4、Biotyper 3.1 和Flexanalysis3.1 ；美國ABI 梯度PCR 儀；質譜儀配套甲酸及基質液；Sigma 公司細菌DNA 提取試劑盒、PCR 反應試劑，法國梅里埃哥倫比亞血瓊脂培養基。

3 基于16srDNA 測序的菌種鑒定 純培養菌落用商品化試劑盒提取全基因組DNA，16srDNA 擴增通用引物序列為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反應體系為30 μl(DNA 模板1μl，上下游引物各3μl，Buffer 3μl，dNTP 2μl，Taq 酶0.2μl，水17.8μl) ；擴增條件為95℃ 5 min，(95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 1 min)×30 循環，72℃ 10 min。擴增產物上機測序，序列結果登錄國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) 網站進行比對，明確菌種。

4 蛋白譜圖的采集 純培養菌落應用甲酸萃取法提取蛋白，吸取1μl 上清，滴加到MALDI 靶板上，每株菌制備到8 個靶位，晾干后滴加HCCA 基質溶液，干燥后上機檢測。打開FlexControl 3.4 軟件采集譜峰：每個靶位采圖3 張，每張圖轟擊100次激光，將獲得的24 張圖譜在Flexanalysis 3.1 中打開，除去低質量的圖譜。將＞20 張的有效圖譜在Biotyper 3.1 中打開，( 若＜20 張則重復試驗)，按照16srDNA 測序鑒定結果輸入菌株名稱，指定路徑和目錄完成建庫過程。

5 數據庫的驗證 以16srDNA 測序鑒定結果為金標準，待鑒定海洋細菌分別用商品化數據庫、自建數據庫和擴展數據庫( 商品庫+ 自建庫) 進行菌種鑒定，與16srDNA 測序鑒定結果一致則為鑒定正確，并記錄鑒定分值，其判斷標準如下：＞2.0 分，為確定種水平的鑒定，可能的種水平鑒定；1.7 ～1.999 分，為可能的屬水平鑒定；＜1.7 為不可靠的鑒定。

6 統計學處理 采用SPSS19.0 統計軟件對不同數據庫的鑒定正確率進行統計分析，觀測資料主要是計數資料，以例數及率表示，組間比較采用χ2檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。與16srDNA測序鑒定結果一致定義為鑒定正確。

結 果

1 自建海洋細菌數據庫菌種信息及質譜圖容量430 株菌經16srDNA 擴增測序后，9 株菌出現雙峰或測序失敗，故421 株菌用于構建數據庫。自建數據庫共包括了32 個菌屬、82 個菌種、421 株細菌的質譜圖，菌株詳細信息見表2。

2 驗證菌株來源與種類 從本課題組前期保存的海洋細菌庫中隨機選取海洋菌株100 株用于數據庫驗證，除1 株測序失敗外，其余99 株經16srDNA測序獲得菌種鑒定結果( 表3)，涵蓋12 個菌屬，29 個菌種，菌株種類的多樣性有助于獲得可靠的數據庫驗證結果。

3 各數據庫鑒定準確率比較 分別用商品化數據庫、自建數據庫和擴展數據庫對99 株菌株進行菌種鑒定，鑒定結果與16srDNA 測序一致時判斷為鑒定正確，擴展數據庫的鑒定準確率優于儀器自帶的商品化數據庫(98% vs 80%，P ＜0.001)。見表4。

討 論

海洋細菌是海洋環境中分布最廣、數量最大的一類微生物，其種類繁多，可通過各種途徑引起人類相關感染，診治不及時可危及生命[8-11]。海上作業人員是海洋細菌感染的高危人群，尤其是隨著海軍艦艇編隊走向深藍，海軍官兵接觸海洋細菌機會增多，引起相關感染風險增大，如食用被海洋細菌污染的食物導致腸道感染，治療不及時可能引起群體性發病，影響任務執行力。此外某些種類的海洋細菌可通過破損的皮膚引起組織嚴重感染[12]，尤其是在戰爭條件下，傷員落水可能引起海洋細菌較為嚴重的感染，影響戰斗力。因此對于海洋細菌引起相關感染的快速診斷和治療至關重要。目前病原菌鑒定多采用傳統的生化反應方法，操作煩瑣且耗時，而分子生物學鑒定僅局限于少數已知特異性序列的細菌，覆蓋面窄。近年來MALDI-TOF MS 突破傳統方法鑒定耗時長、鑒定能力不足等弊端，在臨床得以廣泛應用[13-15]。然而實際應用中MALDI-TOF MS 存在對海洋細菌鑒定能力不足的問題，主要是數據庫資源有限。有研究報道通過擴展數據庫可提高某些目的菌種的鑒定能力[16-19]，本研究對海洋細菌MALDI-TOF MS 數據庫的鑒定能力進行了驗證。

表2 自建數據庫菌種信息Tab. 2 Species information of in-house database

本研究利用菌株的資源優勢建立的本地化海洋細菌MALDI-TOF MS 鑒定數據庫，共包含32 個菌屬、82 個菌種、421 株細菌質譜圖。與商品化數據庫相比，自建數據庫新增了9 個菌屬、22 個菌種、73 株菌的質譜圖。新增菌屬包括食烷菌、德庫菌、大洋單胞菌、大洋桿菌、鞘氨醇桿菌、萊茵海默氏菌、固氮螺菌、卓貝爾氏菌和硝酸鹽還原菌。自建數據庫不僅在數量上豐富了商品化數據庫，在菌株種類上，商品化數據庫部分菌株來源于標準菌株，而自建數據庫中的菌種均來源于海洋環境，更加貼近海洋細菌的鑒定需求。

表3 99 株用于數據庫驗證的菌株信息Tab. 3 Information of 99 strains used for database validation

表4 自建數據庫與商品化數據庫鑒定率比較Tab. 4 Comparison of identification rates of in-house and commercial databases

我們對自建數據庫的鑒定能力進行了驗證，99 株菌分別用自建數據庫、商品化數據庫和擴展數據庫進行菌種鑒定，通過與金標準16srDNA 鑒定結果進行比對，原商品化數據庫鑒定的正確率為80.8%。從鑒定分值來看，＞2.0 的只有44 株菌，＜1.7 的有5 株，盡管這5 株菌鑒定結果正確，但按照判斷標準，＜1.7 的鑒定結果是不可信的，因此應用商品化數據庫進行99 株菌的鑒定，只有75 株菌得到可靠的鑒定結果。自建數據庫的鑒定正確率達到96.0%，94 株菌得到可靠的鑒定結果。擴展數據庫的鑒定正確率高達98.0%，96 株菌得到可靠的鑒定結果。

研究中我們發現，即便是待鑒定菌株的種類存在于商品化數據庫中，也難以與庫中的譜圖很好地匹配。如分離率較高、在海水環境中較為常見的溶藻弧菌，12 株中3 株錯誤鑒定為副溶血弧菌和需鈉弧菌，其余9 株鑒定分數為1.7 ～ 1.99。分析原因可能是菌株的培養方式不同以及數據庫中的菌種與待鑒定菌株之間地域來源不同，導致蛋白譜峰存在一定的差異，所以以各自實驗室常規方式進行菌株的培養和前處理，建立來源廣泛的菌株數據庫，將有助于提高MALDI-TOF MS 的海洋細菌鑒定能力。

綜上所述，本研究通過種類豐富的海洋細菌建立本地化的MALDI-TOF MS 鑒定數據庫，擴展了商品數據庫海洋細菌的種類和數量。經驗證，擴展數據庫能夠提高海洋細菌的鑒定能力。之前未見建立此類數據庫的報道，本研究建立的海洋細菌鑒定數據庫可推廣應用于普通民眾、海洋作業人員感染病原的鑒定，同時也為海軍官兵戰創傷引發海洋細菌感染的診治提供保障。