CXC趨化因子配體8對宮頸癌細胞增殖與遷移的影響及作用機制

符婕 王紅 孫紅梅

(1佳木斯市中心醫院婦產科，黑龍江 佳木斯 154002;2佳木斯市腫瘤醫院腫瘤內科)

宮頸癌(UCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，位居女性所有惡性腫瘤的第四位。在全部惡性腫瘤中UCC也高居前列，是全球第七大惡性腫瘤〔1〕。其發病率存在顯著的地區差異，有超過85%的UCC患者來自于發展中國家，占女性惡性腫瘤的13%。此外，UCC相關死亡率為52%，也多見于發展中國家〔2〕。UCC的危險因素包括慢性炎癥、吸煙、應用口服避孕藥、維生素A和E 攝入不足等〔3〕。趨化因子是一類小分子蛋白質，它們可以調控多種組織的功能，包括內環境的穩態和在炎癥條件下細胞的招募和激活。CXC趨化因子配體(L)8是CXC趨化因子中谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)+亞家族中的一員，它可經其受體CXCR1和CXCR2調控細胞的多種功能。大量研究表明，在適當的刺激下，CXCL8可以被多種細胞所分泌，如單核細胞、內皮細胞、T淋巴細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、上皮細胞、肝細胞、巨噬細胞、滑膜細胞及角質形成細胞等〔4〕。近年來諸多研究表明，CXCL8在多種腫瘤中發生表達上調，并且其可通過多種信號途徑，如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子(NF)-κB而參與并影響腫瘤的增殖、侵襲、轉移和血管形成等〔5〕。本實驗研究外源性及過表CXCL8是否可經內分泌和自分泌機制影響HeLa細胞增殖和遷移的惡性行為，同時探尋CXCL8發揮作用的信號通路。

1 材料與方法

1.1主要細胞、試劑和材料 HeLa宮頸癌細胞(美國典藏細胞庫)；RPMI1640 培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(FBS，美國GIBCO公司)；CXCL8酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢博士德公司)；細胞增殖檢測試劑(CCK)-8試劑盒(碧云天生物)；細胞培養板、培養瓶及細胞遷移(Transwell)小室(美國Hyclone公司)；AKT抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2細胞轉染 將HeLa細胞按5×105個/孔培養在6孔板中，孔板中的培養基為3 ml含15% FBS、無青鏈霉素的RPMI1640 培養基；細胞在95%飽和濕度37℃培養箱中培養36 h；移除培養基，按照Lipofectamine 2000試劑操作手冊對細胞實施轉染；細胞轉染后在37℃培養箱中培養36 h，然后用4 ng/μl的遺傳霉素(G418)進行穩定轉染細胞株的篩選；應用ELISA來鑒定轉染效率。

1.3ELISA 將細胞按6×105個/孔培養于6孔板中，培養基為1 ml含2 % FBS的RPMI1640；待細胞培養24 h后，收集細胞培養上清液并在室溫下離心以去除細胞碎片；按照CXCL8 ELISA試劑盒操作檢測上清液中CXCL8含量。

1.4細胞增殖實驗 為了明確外源性CXCL8是否調控了HeLa細胞增殖，將HeLa細胞按2.0×103細胞/孔接種到96孔板中，細胞所用培養基為100 μl含不同濃度重組CXCL8(0、20、40或60 ng/ml)的RPMI1640；在CXCL8自分泌研究中，將親代、空載體轉染和CXCL8轉染的Hela細胞(1.5×103細胞/孔)培養在96孔板中。將上述實驗細胞在95%飽和濕度的37℃培養箱中分別培養24、48和72 h；按照CCK-8操作后，在酶標儀下讀得450 nm處的光密度值，以確定細胞增殖情況。

1.5細胞遷移實驗 利用Transwell小室進行細胞遷移實驗，進行下列步驟研究外源性及過表達CXCL8對HeLa細胞遷移能力的影響。①外源性研究：將2×104個HeLa細胞重懸于100 μl無FBS的RPMI1640培養基中，并培養于Transwell上室中，將600 μl含10 %FBS和不同濃度重組CXCL8(0、20、40或60 ng/ml)的RPMI1640培養基置于Transwell下室中；②過表達研究：將2×104個親代、空載體轉染和CXCL8轉染的HeLa細胞分別重懸于100 μl無FBS的RPMI1640培養基中，并培養于Transwell上室中，將600 μl含10%FBS的RPMI1640培養基置于Transwell下室中。將上述實驗細胞在95%飽和濕度的37℃培養箱中分別培養24 h和36 h；然后用棉簽刮去小室上表面的非遷移細胞；磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，在室溫下用含0.5%結晶紫溶液的95%乙醇固定染色20 min；PBS清洗后，在顯微鏡下隨機觀察和計數5個視野的遷移細胞。

1.6統計分析 應用SPSS22.0統計學軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1過表達細胞株的篩選 親代、空載體轉染和過表達CXCL8的HeLa細胞培養上清液中CXCL8分泌性蛋白的表達量分別為(205.44±12.91)、(199.86±17.18)和(403.16±17.03)ng/ml。HeLa細胞可表達CXCL8分泌性蛋白。與親代和空載體轉染細胞株比較，過表達細胞株的CXCL8分泌性蛋白水平顯著升高(P<0.01)，提示成功構建了CXCL8穩定轉染細胞株。

2.2外源性CXCL8促進HeLa細胞的增殖 與0 ng/ml CXCL8比較，不同濃度外源性CXCL8可顯著促進HeLa細胞增殖活性(P<0.05)。見表1。

2.3過表達CXCL8促進HeLa細胞的增殖 培養48 h和72 h后，過表達細胞的增殖率顯著高于親代和空載體轉染細胞株(P<0.05)。見表2。

表1 培養不同時間外源性CXCL8促進HeLa細胞增殖光密度)

與0 ng/ml比較：1)P<0.05；2)P<0.01；表3同

表2 培養不同時間過表達CXCL8促進HeLa細胞增殖光密度)

與親代、空載體轉染細胞比較：1)P<0.05；2)P<0.01

2.4外源性CXCL8促進HeLa細胞的遷移 不同濃度的外源性CXCL8可顯著促進HeLa細胞的遷移活性(P<0.05)。見表3。

表3 誘導遷移不同時間外源性CXCL8促進HeLa細胞遷移個)

2.5過表達CXCL8促進HeLa細胞的遷移 過表達細胞的遷移細胞數顯著高于親代和空載體轉染細胞株(P<0.01)。見表4。

表4 誘導遷移不同時間過表達CXCL8促進HeLa細胞遷移個)

與親代、空載體轉染細胞比較：1)P<0.01

2.6過表達CXCL8上調AKT蛋白的表達 親代、空載體轉染及CXCL8過表達細胞AKT蛋白相對表達量分別是0.468±0.10、0.493±0.08和0.980±0.13。與親代和空載體轉染細胞株比較，CXCL8過表達細胞的AKT蛋白相對表達量顯著增高(P<0.01)。

3 討 論

作為促炎性ELR+CXC類趨化因子，CXCL8最初被命名為中性粒細胞趨化因子，這是由于其可通過影響嗜中性粒細胞的趨化與激活，在天然免疫的誘導中發揮重要的調節作用〔6〕。因此，CXCL8與許多炎癥性疾病如炎癥性腸病和類風濕關節炎等密切相關〔5〕。盡管炎癥是機體對組織損傷的一種生理性保護過程，但近年的研究顯示，它在腫瘤的發生、發展及演進中也扮演重要角色。據統計，許多慢性炎癥狀態會顯著增加患某種癌癥的風險，近20%的癌癥是由慢性炎癥或炎癥狀態引發的〔7〕。局部組織的慢性炎癥可使細胞基因組出現不穩定而發生惡變，并進而促進腫瘤細胞的生長、轉移和血管生成。在女性生殖系統中，人類乳頭瘤狀病毒(HPV)感染被認為是宮頸癌進展的主要危險事件，提示炎癥在UCC發生發展中亦發揮重要的作用。

近年來，大量研究表明，CXCL8在多種腫瘤組織中被檢測到表達上調。例如，在前列腺癌中，腫瘤患者血清 CXCL8水平較健康志愿者顯著提高，并且其表達水平與腫瘤的轉移和分期具有顯著相關性〔8〕。又如，CXCL8在膀胱癌中也出現表達上調，它的過度表達與疾病晚期有關，且高表達CXCL8可顯著降低膀胱癌患者的總體生存率〔9〕。另外，大量研究亦揭示了CXCL8參與多種腫瘤的發生及演進過程。如在前列腺癌中，雄激素依賴是腫瘤發展的主要驅動力，Seaton等〔10〕應用體外模型實驗研究了CXCL8信號在驅動雄激素非依賴性轉變中的作用。他們發現，CXCL8可通過雄激素非依賴方式誘導雄激素受體的表達和活化，并促進雄激素依賴前列腺癌細胞 LNCaP和22RV1的增殖。目前人們普遍認為，招募到腫瘤部位的中性粒細胞對腫瘤進程至關重要，特別是腫瘤血管的生成。既然CXCL8的主要生理功能是趨化和激活中性粒細胞，表明CXCL8可參與中性粒細胞介導的腫瘤促進作用。已有研究表明，通過抑制 CXCL8或其受體 CXCR1/2可延緩中性粒細胞向腫瘤部位的招募和趨化，并最終抑制腫瘤在體內生長〔11〕。本研究發現外源性和過表達CXCL8可顯著促進HeLa UCC細胞的增殖和遷移能力，同時機制研究顯示，HeLa細胞過表達CXCL8可顯著上調AKT蛋白的表達。這說明CXCL8可經PI3K/AKT信號途徑參與UCC的惡性轉化進程，該研究將補充人們對UCC發生機制的認識，并可為其臨床診治提供一定的借鑒思路。