ILT3在冠心病患者外周血單核細胞的表達及意義

劉曉峰 陳玲 廖然 殷錫虎 汪光枝

(九江市第一人民醫(yī)院 南昌大學附屬九江醫(yī)院心血管內(nèi)科，江西 九江 332000)

冠心病的嚴重程度由斑塊的穩(wěn)定性決定，炎癥免疫反應在斑塊穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用〔1〕。研究表明免疫調(diào)節(jié)失衡在不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其中T淋巴細胞參與動脈粥樣硬化相關抗原的應答反應，促進動脈粥樣斑塊的發(fā)生和進展〔2〕。最新研究發(fā)現(xiàn)自身免疫在冠心病中可能發(fā)揮著重要作用〔3〕。樹突細胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)的機體內(nèi)功能最強的專職抗原提呈細胞,極少量的DC即可強烈激活T淋巴細胞啟動特異性細胞免疫反應〔4〕。T淋巴細胞的激活可能在冠狀動脈粥樣硬化起始和斑塊的穩(wěn)定性中起重要作用〔5〕。免疫球蛋白樣轉錄子(ILT)3，屬于抑制性受體，可表達于DC和T淋巴細胞表面，在免疫反應中發(fā)揮重要作用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)在急性冠脈綜合征(ACS)患者的破裂斑塊中和外周循環(huán)血均可檢測到異常增殖的T細胞〔7〕。本研究首先檢測冠心病患者外周血單個核細胞(PBMC)中ILT3的表達，再通過在體外建立混合淋巴細胞反應(MIR)，進一步探討ILT3參與冠心病發(fā)生發(fā)展的免疫機制。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2014年1月至2017年12月九江市第一人民心血管內(nèi)科心內(nèi)科住院冠心病患者100例，所有患者依據(jù)病史、心絞痛癥狀、心電圖、心肌酶學檢查結果分為：穩(wěn)定性心絞痛(SAP)組45例，男25例，女20例，年齡(61±10)歲;ACS組55例，男43例，女12例，年齡(56±8)歲。所有患者經(jīng)冠狀動脈造影檢查證實。排除標準：合并急慢性感染、膠原結締組織病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、周圍血管病、惡性腫瘤、進展期肝腎病者；服用免疫抑制劑、非甾體類炎癥抑制劑等藥物。本研究獲得九江市第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有入選者簽署知情同意書。兩組年齡及性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2研究方法

1.2.1PBMC的分離 采用Ficon密度梯度離心法：所有患者在入院24 h內(nèi)，在無菌條件下，空腹抽取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血10 ml用RPMI1640 1∶1培養(yǎng)稀釋到20 ml，用毛細滴管插到云霧層，全部吸取單個核細胞(避免吸出分層液)，置入另一離心管中，然后加入5倍以上體積的RPMI1640液，1 500 r/min×10 min，洗滌細胞兩次，獲得PBMC。

1.2.2外周血DC分離和體外培養(yǎng) 在無菌條件下，用37℃無血清的RPMI1640液體培養(yǎng)基充分吹打上述分離得到的PBMC，使成均勻細胞懸液，用濃度為50 ng/ml的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和50 ng/ml的重組人白細胞介素(rhIL)-4,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5 d。第6天加入白細胞介素(IL)-1β(10 ng/ml),腫瘤壞死因子(TNF)-α(50 ng/ml)和Toll樣受體配體polyⅠ:C(20 μg/ml),均購自美國Sigma公司。繼續(xù)培養(yǎng)2 d,第8天收獲懸浮細胞，顯微鏡下鑒定。

1.2.3應用MACS 免疫磁珠陰性分選得CD4+T淋巴細胞 采用Ficon密度梯度離心法分離臍帶血獲得的PBMC，用RPMI1640 1∶1培養(yǎng)稀釋到10 ml，采用應用MACS 免疫磁珠陰性分選，將分選獲得的CD4+T淋巴細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度在1×106/ml，備用。提取的CD4+T調(diào)節(jié)性T細胞以流式細胞儀行純度檢測。

1.2.4細胞因子檢測 各組分離培養(yǎng)的DC和臍血分離的CD4+T細胞混合培養(yǎng)。4 d后,收集細胞培養(yǎng)上清,利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測干擾素(IFN)-γ、TNF-β和IL-10細胞因子水平,在酶標儀上,于450 nm波長處檢測光密度(D)值。用流式細胞儀檢測CD4+CD25+T淋巴細胞的百分比，實驗重復3次。

1.2.5流式細胞術檢測樣品 上述分離純化的細胞用10%FBS RPMI1640調(diào)整細胞濃度為1×106/ml,取細胞懸液100 μl，分別加入6 μl CD4-PE、6 μl ILT3-FITC抗體，混合反應后，操作同前，上流式細胞儀檢測;然后獲取條件分別為CD4-PE、CDILT3-FITC陽性。依次收集標本，收集細胞數(shù)至少5 000個細胞，分析熒光強度，數(shù)據(jù)存盤，測試結束后在計算機上用CellQustPlot軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算獲得細胞百分數(shù)表示。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t及χ2檢驗。

2 結 果

2.1ILT3在兩組PBMC的表達 SAP組PBMC的ILT3 陽性率為〔(80.13±2.10)%〕，顯著高于ACS組〔(1.83±0.91)%，P<0.01〕。

2.2兩組CD4+CD25+T淋巴細胞百分比比較 SAP組CD4+CD25+T淋巴細胞數(shù)量百分比為〔(89.2±2.3)%〕，較ACS組〔(39.5±5.3)%〕明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3兩組細胞因子水平比較 ACS組IFN-γ和TNF-β水平比SAP組明顯升高，IL-10水平在SAP組比ACS組有明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 兩組細胞因子水平比較

與SAP組比較：1)P<0.01

3 討 論

研究表明，炎癥免疫反應參與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展以致易損斑塊和血栓的形成〔8〕。其中T細胞參與的免疫激活在冠脈斑塊破裂中起主導作用〔9〕。急性冠狀動脈綜合征(ACS)的發(fā)生中，冠狀動脈易損斑塊的形成可能是T細胞介導的一種免疫失衡性疾病〔10〕。研究表明,在機體免疫耐受的產(chǎn)生和維持中起重要作用的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞，通過負向調(diào)節(jié)來抑制自身反應性T細胞的作用,發(fā)揮免疫耐受，減少炎癥免疫性疾病的發(fā)生〔11〕。盡管目前尚未將動脈粥樣硬化歸類于自身免疫性疾病。但有動物實驗研究顯示CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞能夠增加斑塊的穩(wěn)定性〔12〕。研究已經(jīng)表明CD4+CD28-T淋巴細胞能夠直接溶解內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞，而導致斑塊破裂〔13〕，與CD4+CD28-T細胞亞群作用相反,CD4+CD25+T是最近研究發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T細胞亞群之一，參與調(diào)節(jié)與冠狀動脈斑塊的穩(wěn)定性〔2〕。ILT3可表達于DC表面，傳導抑制性信號，抑制殺傷性NK 細胞的活性，參與細胞抗原俘獲、抑制細胞炎癥免疫作用〔14〕。 有研究表明，高表達ILT3的DC細胞可抑制T淋巴細胞的增殖與活化〔15〕。ILT3可通過抑制DC的共刺激分子的表達，同時誘導CD4+T細胞轉化為CD4+CD25+T的調(diào)節(jié)性T細胞〔16〕。本研究結果顯示PBMC中ILT3表達的變化參與冠心病的發(fā)生發(fā)展中。

將抗原特異性CD4+CD25+T淋巴細胞輸入小鼠觀察到其可抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展,說明CD4+CD25+T淋巴具有負向調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化炎癥反應的作用〔17〕。急性心肌梗死患者CD4+CD25+T淋巴細胞表達百分比與正常對照組相比會降低，這表明可能在冠狀動脈粥樣斑塊活動或破裂過程中發(fā)揮重要作用〔18〕。本研究推斷CD4+CD25+T淋巴細胞對維持動脈粥樣硬化患者斑塊的穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用且與ILT3高表達相關。

抗原提呈細胞是啟動免疫應答的起始環(huán)節(jié)，DC是目前發(fā)現(xiàn)的機體內(nèi)功能最強的專職抗原提呈細胞，最近發(fā)現(xiàn)在冠狀動脈粥樣硬化斑塊中DC增多〔19〕。成熟的DC可分泌多種細胞因子，參與T淋巴細胞的增殖和免疫調(diào)節(jié)功能〔20〕。本研究提示高表達ILT3的DC釋放IL-10而穩(wěn)定斑塊。