月季高效增殖和生根條件的優(yōu)化研究

王藝程 楊柳燕 張永春 楊 玲

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海市奉賢區(qū) 201403；2上海源怡種苗股份有限公司，上海市浦東新區(qū) 201204）

月季是薔薇科薔薇屬木本植物，原產(chǎn)于中國(guó)，具有很高的觀賞價(jià)值，被譽(yù)為花中皇后，深受人們喜愛(ài)。但月季為木本植物，生長(zhǎng)繁殖速度較慢[1]，而隨著月季產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，市場(chǎng)對(duì)月季種苗的需求量越來(lái)越大，傳統(tǒng)的無(wú)性繁殖手段已無(wú)法滿足市場(chǎng)需要。研究表明，月季的組培繁殖率遠(yuǎn)高于無(wú)性繁殖手段，且通過(guò)組培繁殖的新苗不僅能保留原品種的優(yōu)良性狀，且耗時(shí)短[2]。因此，諸多研究建立了以月季腋芽為材料、通過(guò)器官發(fā)生途徑的快繁技術(shù)體系，以幼嫩葉片及合子胚為材料、通過(guò)誘導(dǎo)愈傷分化途徑的再生體系，以葉片和莖段為材料、通過(guò)月季體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的快繁技術(shù)體系，然而這些研究均存在組培苗再生頻率低、組培技術(shù)體系不穩(wěn)定等問(wèn)題，因此優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)仍難以滿足市場(chǎng)需求[3]。在此背景下，為進(jìn)一步優(yōu)化月季增殖和生根條件，提高月季增殖率和生根率，筆者在前期工作的基礎(chǔ)上，對(duì)月季組培苗增殖和生根的最適培養(yǎng)基配方進(jìn)行了篩選，以期完善月季的組培快繁技術(shù)體系，為實(shí)現(xiàn)其規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為誘導(dǎo)產(chǎn)生的月季試管苗，品種代號(hào)為“5002”。試驗(yàn)于2017年3月—6月在上海市植物種苗組培平臺(tái)組培室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 月季離體增殖技術(shù)

供試材料為初代誘導(dǎo)產(chǎn)生的月季試管苗。增殖培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA（6-芐基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸），另加蔗糖30 g/L、瓊脂4 g/L，共設(shè)9個(gè)處理，見表1。

表1 月季增殖培養(yǎng)基中激素配比

選取苗高≥2.5 cm的月季試管苗，用解剖刀切成長(zhǎng)0.5～1.0 cm的莖段，每個(gè)莖段都帶有1張葉片，區(qū)分好植物形態(tài)學(xué)上下端，然后垂直接種于培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種5個(gè)莖段。在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1 000～2 000 Lux。

每隔3 d觀察1次，去除被污染的外植體，培養(yǎng)45 d后，統(tǒng)計(jì)增殖情況，即統(tǒng)計(jì)試管苗個(gè)數(shù)，測(cè)量其高度、葉長(zhǎng)、葉片數(shù)、莖粗，記錄各配方最低苗高和最高苗高并進(jìn)行比較，計(jì)算增殖系數(shù)和平均高度、平均葉長(zhǎng)、平均葉片數(shù)、平均莖粗，觀察生長(zhǎng)狀況等。

計(jì)算公式：增殖系數(shù)=試管苗個(gè)數(shù)÷發(fā)生增殖的外植體數(shù)，平均高度=∑各苗高度÷試管苗個(gè)數(shù)，平均葉長(zhǎng)=∑各苗葉長(zhǎng)÷總?cè)~片數(shù)，平均莖粗=∑各苗莖粗÷試管苗個(gè)數(shù)，平均葉片數(shù)=∑各苗葉片數(shù)÷試管苗個(gè)數(shù)。

1.2.2 月季試管苗生根試驗(yàn)

供試材料為增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的月季試管苗。生根培養(yǎng)以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA和AC（活性炭），另加蔗糖30 g/L、瓊脂4 g/L，共設(shè)9個(gè)處理，見表2。

表2 月季生根培養(yǎng)基中NAA和AC濃度配比

在超凈工作臺(tái)上用解剖刀將繼代增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的試管苗（苗高≥2.5 cm）一株一株分開，接種于9種不同激素配比的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件同1.2.1。每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種5株增殖苗。

每天觀察各培養(yǎng)基上試管苗的生根情況，培養(yǎng)38 d后統(tǒng)計(jì)生根指標(biāo)數(shù)據(jù)，即統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理生根試管苗數(shù)、各苗根數(shù)，測(cè)量根長(zhǎng)、根粗、第三節(jié)高度（由上往下數(shù)第三節(jié)）、葉長(zhǎng)，計(jì)算生根率、平均根長(zhǎng)、平均根數(shù)、平均葉長(zhǎng)、平均根粗、第三節(jié)平均高度。

計(jì)算公式：生根率=（生根苗數(shù)÷接種苗數(shù)）×100%，平均根長(zhǎng)=總根長(zhǎng)÷生根外植體數(shù)，平均根數(shù)=總根數(shù)÷生根外植體數(shù)，第三節(jié)平均高度=∑各苗第三節(jié)高度÷外植體數(shù)，平均葉長(zhǎng)=∑各苗葉長(zhǎng)÷總?cè)~片數(shù)，平均根粗=∑各苗根粗÷各苗總根數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用ANOVA 9（方差分析）對(duì)處理間進(jìn)行差異性測(cè)驗(yàn)，采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同增殖培養(yǎng)基上月季試管苗的增殖和生長(zhǎng)情況

由表3可知，培養(yǎng)基配方中不同濃度的6-BA與NAA組合對(duì)月季試管苗的增殖影響存在差異。在6-BA為0.5 mg/L時(shí)，隨著NAA濃度的升高，增殖系數(shù)呈先下降后升高的趨勢(shì);在6-BA為1.0 mg/L時(shí)，隨著NAA濃度的升高，增殖系數(shù)呈先上升后降低的趨勢(shì);在6-BA為2.0 mg/L時(shí)，隨著NAA濃度升高，增殖系數(shù)呈先下降后升高的趨勢(shì)。在NAA為0.1 mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度的升高，增殖系數(shù)呈先下降后升高的趨勢(shì)；在NAA為0.2～0.3 mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度的升高，增殖系數(shù)呈先上升后降低的趨勢(shì)。各處理間增殖系數(shù)差異達(dá)顯著水平，G2處理的增殖系數(shù)最低，為1.29，且G2處理的試管苗有黃葉和愈傷組織，葉片??；G1處理和G9處理的增殖系數(shù)雖較高，但G1處理的試管苗有少量黃葉，且基部有愈傷組織，G9處理的試管苗畸形，葉彎曲，且部分苗的基部有愈傷組織；G5處理的增殖系數(shù)最高，為2.71，且G5處理的試管苗正常生長(zhǎng)并生長(zhǎng)健壯。

經(jīng)綜合考慮，以G5處理，即以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂4 g/L為月季試管苗的最佳增殖培養(yǎng)基配方。

表3 不同增殖培養(yǎng)基上月季試管苗的增殖和生長(zhǎng)情況

2.2 不同生根培養(yǎng)基上月季試管苗的生根和生長(zhǎng)情況

由表4可知，培養(yǎng)基配方中不同濃度的NAA與AC組合對(duì)月季試管苗生根及生長(zhǎng)的影響存在差異，加入活性炭對(duì)月季試管苗生根有促進(jìn)作用。在NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，隨著AC濃度的升高，平均生根率呈下降的趨勢(shì);在NAA濃度為1.0 mg/L時(shí)，隨著AC濃度的升高，平均生根率呈先下降后升高的趨勢(shì);在NAA濃度為2.0 mg/L時(shí)，隨著AC濃度的升高，平均生根率呈下降的趨勢(shì)。S5處理的平均生根率最低，為68%；S4處理和S6處理的平均生根率最高，均為100%，但S4處理的試管苗根細(xì)長(zhǎng)且根系脆、易斷，有少量枯黃葉和少量側(cè)根，S6處理的試管苗有少量褐枯黃葉，葉卷曲；S1處理的平均生根率排名第2，達(dá)98%，但試管苗葉色有枯黃，有少量側(cè)根，且根系易斷；S7處理的平均生根率排名第4，達(dá)96%，試管苗根長(zhǎng)、粗壯，僅有少量黃葉，但根易斷，且根系有部分褐色；S2處理的平均生根率達(dá)94%，僅有少量褐枯黃葉，且根系有彈性，不易斷，更適于移栽成活。

經(jīng)綜合考慮，以S2處理，即以1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂4 g/L為月季試管苗的最佳生根培養(yǎng)基配方。

3 結(jié)論與討論

3.1 激素對(duì)月季試管苗增殖的影響

細(xì)胞分裂素有抑制植物頂端優(yōu)勢(shì)的作用，因而能促進(jìn)側(cè)枝的萌發(fā)和生長(zhǎng)，主要是影響腋芽的增殖。生長(zhǎng)素最主要的作用是促進(jìn)生長(zhǎng)，促進(jìn)作用因濃度而異，較低濃度促進(jìn)生長(zhǎng)，較高濃度抑制生長(zhǎng)[4]。曹偉杰等[5]的研究結(jié)果表明，月季品種“紅雙喜”叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，6-BA和NAA對(duì)月季叢生芽的增殖起著協(xié)同作用，6-BA能促進(jìn)叢生芽萌發(fā)，而適量NAA能使叢生芽生長(zhǎng)健壯，但過(guò)高的6-BA會(huì)誘發(fā)芽苗玻璃化。在月季組織培養(yǎng)過(guò)程中，激素配比除了要考慮增殖系數(shù)外，還應(yīng)考慮不定芽的質(zhì)量，增殖系數(shù)過(guò)大，往往會(huì)伴隨發(fā)生芽生長(zhǎng)細(xì)弱、節(jié)間拉長(zhǎng)等現(xiàn)象，出現(xiàn)不易生根或移栽成活率下降等問(wèn)題。同時(shí)，生長(zhǎng)素濃度較高會(huì)抑制細(xì)胞分裂，使某些芽的萌發(fā)受到明顯抑制[6]。謝曉靜等[7]以現(xiàn)代月季主栽品種“博”的莖段為外植體進(jìn)行研究，BA和IBA的合適濃度配比，對(duì)月季側(cè)芽的發(fā)育、生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用；張宇斌[8]的研究結(jié)果表明，增殖培養(yǎng)基的最佳激素濃度為MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L。此外，細(xì)胞分裂素(6-BA)與生長(zhǎng)素(NAA)的比值較低時(shí)，可誘導(dǎo)根的分化，兩者比值適中時(shí)，可產(chǎn)生愈傷組織，兩者比值較高時(shí)，可誘導(dǎo)芽的分化。

表4 不同生根培養(yǎng)基上月季試管苗的生根和生長(zhǎng)情況

本試驗(yàn)結(jié)果表明，月季“5002”試管苗的最佳增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂4 g/L，在此培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的叢生苗長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，葉片大小正常，顏色鮮綠，平均高度為2.67 cm，平均葉長(zhǎng)為1.32 cm，平均葉片數(shù)為7.53張，平均莖粗為2.47 mm，平均增殖系數(shù)達(dá)2.71。

3.2 激素和活性炭對(duì)月季試管苗生根的影響

曹偉杰等[5]的研究結(jié)果表明，月季品種“紅雙喜”芽苗再生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.05 mg/L，NAA能促進(jìn)再生根的誘導(dǎo)，然而，NAA濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致再生根生長(zhǎng)不正常，對(duì)瓶苗生長(zhǎng)不利，尤其對(duì)瓶苗的后期移栽成活非常不利。因此，NAA適合濃度的確定，不僅要考慮芽苗的生根率和生根數(shù)，還要考慮瓶苗的移栽成活率[5]。而張宇斌[8]研究結(jié)果表明，月季組培苗生根的最佳激素濃度為NAA 0.5 mg/L，培養(yǎng)10 d就能誘導(dǎo)根的形成，其生根率為90%。本試驗(yàn)篩選出的最優(yōu)生根培養(yǎng)基配方中加入的激素及濃度也是NAA 0.5 mg/L，這和張宇斌等的研究結(jié)果一致。

孫占育[9]認(rèn)為活性炭對(duì)植物組織培養(yǎng)生根的作用主要表現(xiàn)在：可提供生根的暗環(huán)境，防止根系褐變，有利生根，也有利于提高培養(yǎng)苗體內(nèi)的可溶性蛋白和總糖含量，能吸附植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與其他有機(jī)物等有利生根的物質(zhì)。因此，在植物組織培養(yǎng)生根中，選擇合適的活性炭濃度有利于生根。本試驗(yàn)結(jié)果表明，以在培養(yǎng)基配方中加入AC 1.0 g/L為較好，且加入活性炭處理的試管苗比沒(méi)有加活性炭處理的試管苗根系更有彈性，顏色潔白，且更有利于移栽成活，表明在月季試管苗生根培養(yǎng)基中加入活性炭，對(duì)生根起到了促進(jìn)作用，這與孫占育的研究結(jié)論一致。