猴頭菇液體菌種發酵罐內培養條件的研究*

黃蓓蓓

（1.河南科技大學 應用工程學院，河南 三門峽 472000；2.三門峽職業技術學院，河南 三門峽 472000）

目前，我國液體菌種技術已經在國際上遙遙領先，液體菌種已經廣泛應用到黑木耳、金針菇、杏鮑菇、靈芝、猴頭菇等食用菌上。液體菌種發酵技術及培養設備為食用菌液體菌種發酵培養奠定了基礎，在此背景下，根據罐內培養試驗設計，以猴頭菇為例觀察其液體菌種在罐內培養中的發酵過程，分析不同碳源、氮源、pH、溫度等因素對菌絲生長的影響，對不斷優化猴頭菇液體菌種培養方案以及促進整個食用菌行業發酵培養技術發展具有重要意義。

1 猴頭菇生產概述

1.1 猴頭菇及其生態環境

猴頭菇（Hericium erinaceus） 是我國傳統的“藥食同源”的真菌，因其具有重要的食用價值和藥用功效而受到了消費者的廣泛喜愛[1]。我國食用猴頭菇的歷史由來已久，民間早有“多食猴頭，返老還童”之說，而《本草綱目》 中關于猴頭菇的記載“猴頭菇性平、味甘，具有利五臟、健脾益胃的功能”。隨著現代對猴頭菇研究的深入，還發現了猴頭菇能用于治療胃病、神經衰弱等疾病，其中的多糖還具保護肝臟、抗衰老、氧化、抗癌等功效。目前來說，包括猴頭菇在內的食用菌主要有2 種生產方式，根據食用菌培養的生態環境的不同，可以分為固體培養和液體培養，而對猴頭菇來說后者更具優勢。猴頭菇液體菌種培養可將其制袋或裝罐，以罐內培養的方式準備猴頭菇發酵所需的培養基，液體培養的方式能夠有效減少成本，接種簡便，更加適用于現如今食用菌生產的工廠化進程。

1.2 猴頭菇次級代謝產物

猴頭菇中的萜類化合物最早是由美國學者Kawagishi 于1990 年從猴頭菇菌絲體中發現，其對促進神經生長因子合成十分有效；提取的甾醇類化合物能夠阻斷致癌物誘發癌細胞形成，預防心血管疾??；提取的生物堿類化合物，具有抗炎活性。2015 年，我國學者汪鍇進一步從猴頭菌菌絲體中分離出了葡萄糖苷酶抑制活性的生物堿[2]。同時，猴頭菇也含有其他食用菌普遍含有的活性成分，包括酚類、脂肪酸等。

1.3 猴頭菇液體發酵罐內培養的要求

猴頭菇的罐內發酵需要具備一定的條件。首先碳源占據猴頭菇菌體元素的60%及以上，因此碳源也是猴頭菇液體培養重要的營養來源，罐內培養對碳的需求量大，因此可以充分利用葡萄糖、纖維素、果膠、淀粉等高分子有機物，滿足猴頭菇罐內培養發酵的要求，但是需注意食用菌屬于低糖發酵，因此罐內培養基的含糖量不宜超過5%[3]。氮源是猴頭菇菌種發酵的重要元素，氮源充足會幫助菌絲獲得充足的生長，需要將罐內培養基氮濃度控制在0.15%~0.30%，過多會導致猴頭菇次級代謝產物減少，不足則引起菌絲生長不良。此外，pH 也影響猴頭菇的生長，一般來說，大多數食用菌習慣于偏酸性的環境，適宜的pH 在5~7；食用菌對溫度環境要求高，罐內培養的溫度應嚴格加以控制，根據各個生長階段的不同形成最適宜子實體生長的溫度[4]。

2 猴頭菇液體菌種發酵罐內培養的材料與方法

2.1 試驗材料準備

菌種猴頭菇；液體發酵培養罐；馬鈴薯、淀粉碳源培養基（PDA）；基礎發酵培養基：酵母膏1 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1。

2.2 試驗方法過程

2.2.1 液體菌種的制備

取用準備好的猴頭菇菌種接種于罐內培養基中，將溫度控制在25℃以下，滿足1∶5 的比例[5]。發酵培養基方案根據試驗數據逐次進行調整，直至找到最適宜猴頭菇發酵的罐內培養設計方案。

2.2.2 最適猴頭菇培養基的正交試驗設計

根據液體菌種制備的方案，進行猴頭菇最適培養基的正交試驗設計，將上述培養基的試驗因素進行編號，以對猴頭菇罐內培養方案進行直觀對比，見表1。

表1 猴頭菇罐內培養基因素水平Tab.1 Factors and levels of the medium of Hericium erinaceus

2.2.3 猴頭菇液體菌種罐內發酵條件的確定

猴頭菇液體菌種培養條件的確定罐內發酵液中的最佳碳源與最佳氮源，通過方案對比得出最佳碳氮比，由此決定發酵終點時間。要選擇猴頭菇菌絲體發酵最適宜的pH，進行菌絲體最適宜發酵溫度的研究。分別對馬鈴薯（A）、淀粉（B）、酵母膏（C）、KH2PO4（D）、MgSO4·7H2O（E） 進行成分測定比較。在發酵過程中注意檢測罐內發酵液pH、猴頭菇菌絲體粗多糖、生物量的參數的變化。

2.2.4 菌絲干重數據的采集

對猴頭菇生長的菌絲測量，選用細胞干重法，取一定比例的培養液，通過轉速搖床收集菌絲球，將菌絲用水洗凈并用蒸餾法，控制溫度為80℃烘干至衡重[6]，獲得猴頭菇菌絲的干重，并稱重。

3 猴頭菇液體菌種發酵罐內培養的結果

3.1 不同碳源對猴頭菇液體菌種發酵的影響

在猴頭菇液體菌種發酵罐內培養過程中，碳源應占據猴頭菇培養基的60%及以上，有碳源存在才能維持猴頭菇菌種生長需要的生命活力，幫助猴頭菇產生萜類、甾醇類、生物堿、酚類、脂肪酸等次級代謝物[7]。在罐內培養基中，能夠利用多種含碳的材料作為猴頭菇液體發酵的碳源，包括淀粉、葡萄糖、甘露醇、糊精、乳糖等，既能滿足猴頭菇菌種發酵對碳源的要求，又能保證在低糖的培養基環境中達到菌絲產量的最高化，見圖1。

由圖1 可知，不同碳源對猴頭菇液體發酵后菌絲干重的影響，甘露醇、糊精、乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖均可為猴頭菇菌種發酵提供碳源，但以葡萄糖和淀粉2 個碳源產出的猴頭菇菌絲產量最高，為葡萄糖時達到4.79 g·L-1，淀粉時達4.46 g·L-1。其中乳糖作為培養基碳源出現碳源供給不足的情況。

3.2 不同氮源對猴頭菇液體菌種發酵的影響

氮源是構成猴頭菇生物體的重要成分，試驗選擇豆餅粉、玉米粉、麥麩、牛肉膏、酵母膏作為罐內培養基中的氮元素來源，通過逐次試驗對比得出最適宜的猴頭菇菌種發酵氮源，具體見圖2。

由圖2 可知，選擇的罐內培養基氮源樣本總體來說對菌絲干重影響不大，但秉持最大程度節約成本的態度，在選擇酵母膏時，產出的猴頭菇菌絲干重比例最多，因此在實際生產過程中，可以廣泛選擇酵母膏作為氮源。

3.3 不同溫度對猴頭菇液體菌種發酵的影響

在進行猴頭菇罐內培養過程中，要根據猴頭菇不同生長階段對不同溫度的要求進行溫度控制，為直觀對產出的猴頭菇菌絲干重作比較，在逐次進行罐內培養時將培養基溫度控制在20℃~30℃，確定具體溫度為23℃、25℃、27℃、29℃。其他碳源、氮源、溫度條件相同，見圖3。

由圖3 可知，在不同溫度的罐內培養條件下，猴頭菇液體發酵菌絲產出差異顯著，其規律是從23℃起，猴頭菇液體發酵產出菌絲隨溫度的升高而產量增大，但當達到了27℃時則開始呈現下降的趨勢，因此在27℃的罐內培養基溫度條件，產生的菌絲體生物數量值最大。事實上，對猴頭菇液體菌種發酵的罐內培養來說，溫度對猴頭菇內部分次級產出物會有所影響，因而溫度低菌體生長趨緩，菌絲干重也就??；溫度逐漸升高則菌體也隨之生長，菌絲干重數值增大[8]。

3.4 不同pH 對猴頭菇液體菌種發酵的影響

根據食用菌普遍對pH 要求偏酸性的特點，設定猴頭菇液體菌種發酵的罐內培養基pH 分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，對猴頭菇菌種進行罐內培養，其他氮源、碳源、溫度條件不變，具體見圖4。

根據圖4 可知，當猴頭菇液體菌種發酵的罐內培養基pH 達到5.5 時，菌絲體生物量最大，其它pH 情況下則對猴頭菇產出菌絲影響不大。但是在進行猴頭菇乃至其他食用菌液體菌種發酵的培養時，必須充分考慮食用菌對pH 的要求，對猴頭菇來說，不宜在堿性培養基環境下進行液體發酵，要注重適度原則，過酸或過堿都會影響猴頭菇菌絲的生長，要將猴頭菇罐內培養環境控制在弱酸環境下。

4 對猴頭菇液體菌種發酵罐內培養建議

4.1 正確操作發酵罐是獲得優質猴頭菇液體菌種的關鍵

進行猴頭菇液體菌種發酵前，需要進行發酵罐的清理和消毒工作，對于長時間未使用的發酵罐要及時進行高溫蒸汽消毒，有必要的情況下進行滅菌，高溫后也應對設備及時進行冷卻，溫度過高容易引起食用菌菌種的死亡，例如猴頭菇液體菌種發酵的溫度就須得控制在27℃左右。此外，罐內培養還需注意的是要對罐壓進行控制，最好保持發酵罐內部壓力大于罐外壓力。

4.2 持續把好猴頭菇液體菌種的質量關

對菇農來說，對合格液體菌種的判斷存在著困難，因此需要把好猴頭菇液體菌種的質量關，為后續生產建立良好的基礎。人工液體菌種發酵需要按時觀察，并記錄參數變化，罐內培養可以采用“三看一聞一測”的質量檢測法，三看：看罐內培養基顏色、菌液清澈度、看菌絲數量增長情況；一聞：聞罐內菌液味道；一測：測定pH，保證罐內pH 維持在5.5 的值域內，當pH 下降到4，說明罐內存在雜菌生長，將不能再用于接種。

4.3 罐內培養料水分控制是發菌成敗的關鍵

液體菌種培養要適當控制養料的加水比例，罐內水分少，培養基則不能長效吸收菌液水分，猴頭菇菌絲不能有效獲得培養基的吸附，久而久之影響菌絲生長。罐內水分多，又會導致接入的菌種受到擠壓和浸泡，導致菌絲死亡。對于猴頭菇這樣耐水性好的菌類，罐內培養液體菌種時將含水量控制在58%~62%即可。

4.4 把握菌絲生理成熟時間，及時誘導出菇

相對于固體菌種，液體菌種發酵顯然具有更大的優勢。猴頭菇液體菌種接種后吸收培養基營養快，菌絲萌發快，周期短。雖然液體菌種能夠有效縮短發酵時間，但是也需要結合實際誘導菌絲出菇。要針對猴頭菇的特點，猴頭菇成熟時間早，當菌絲吃料超過2/3 時，就可以恰當安排出菇時間，即一邊發菌一邊出菇。

5 結論

通過對猴頭菇液體菌種發酵罐內培養基因素進行設計分析，在碳源需求上，葡萄糖、淀粉較之于其他碳源來說，能夠最大程度地為猴頭菇液體發酵提供碳源，在滿足猴頭菇碳源需求大的基礎上同時保證猴頭菇在低糖發酵的環境下產出菌絲；各類氮源對猴頭菇液體菌種發酵影響因素不大，但秉持節約成本的思路，在進行液體菌種的工廠化生產過程中，普遍選用酵母膏最為合適；猴頭菇對溫度的需求保持在23℃~29℃，以27℃為臨界點；罐內pH 維持在5.5 最適宜猴頭菇液體菌種發酵。通過逐次進行培養基試驗，得出猴頭菇液體菌種發酵最優化方案，為猴頭菇乃至為其他同類型的真菌液體發酵提供參考，同時加快食用菌液體菌種發酵的工廠化進程，促進食用菌行業的發展。