萊茵衣藻纖毛內運送蛋白IFT57 抗原的原核表達、純化及其多克隆抗體的制備

韓鵬飛， 閆 珍， 樊振川*

（1. 天津科技大學 大健康生物技術研究所 天津300457；2. 天津市大健康生物技術國際聯合研究中心 天津300457；3. 天津科技大學 食品工程與生物技術學院，天津300457）

萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是一種單細胞真核藻類，它屬于綠藻門（Chlorophyceae），等鞭毛綱 （Isokontae）， 團藻目 （Volvocales）， 衣藻屬（Chlamydomonas）。 衣藻屬約100 多種，其中萊茵衣藻在遺傳學方面研究得較為全面[1]。 其細胞一側具有兩條等長的纖毛，賦予萊茵衣藻游動的能力[2]。 纖毛是由細胞微管為主構成的，一種細胞表面突起的亞細胞結構。 纖毛的進化非常保守，廣泛分布于原生生物到脊椎動物的真核細胞的細胞表面[3]。

“鞭 毛 內 運 輸”（intraflagellar transport， 簡 稱IFT）是發生于纖毛軸絲和纖毛膜之間，由IFT 蛋白顆粒的兩個亞蛋白復合物IFT-A 和IFT-B，經其不同偶聯的馬達蛋白作用，從纖毛基部到頂端的一種蛋白質復合體的雙向運輸過程[4-6]。 IFT 對纖毛的組裝、維持和解聚起到決定性作用。 纖毛具有極高的復雜性，在調控繁多的細胞生理活動和復雜的動物發育過程中具有重要作用。 纖毛亞基蛋白IFT-A 和IFT-B 的突變， 會引起纖毛運動性的喪失或纖毛的缺陷，從而導致人類出現肥胖、糖尿病、內臟轉移、多囊腎病、色素性視網膜炎、復性呼吸道感染、不育癥、智力遲鈍、多趾等癥狀[7]。 因此，研究IFT 蛋白顆粒復合物相關作用對纖毛病的發病機理和預防顯得尤為重要。

最近，生物學研究發現IFT-B 由兩個亞基復合物IFT-B1 和IFT-B2 構成，IFT-B2 中的蛋白IFT57位于IFT-B1 和IFT-B2 之間[8-9]。 IFT57 是與運動有關的蛋白質，IFT57 在鞭毛內運輸中起到阻止IFT顆粒復合物降解的功能，在鞭毛組裝中發揮著重要作用，它的缺失會導致纖毛的缺陷，影響細胞的游動[10]。 因此，制備萊茵衣藻IFT57 抗體，為進一步研究其維持纖毛長度和功能提供了前提。

原核表達系統具有表達量高、 培養成本低、方法簡單、穩定性好等優點，利用該系統表達蛋白質、制備抗體已經相當成熟[11-12]。 作者利用該系統表達ift57基因中一段編碼親水性氨基酸序列的片段，進行蛋白質的親和純化和抗原抗體的反應，比表達全基因序列具有快捷、高效、經濟的優勢，為原核表達一系列溶解性差、高相對分子質量、難純化蛋白質提供了一定的借鑒意義。 為深入研究IFT57 在鞭毛內運輸中的作用機理，為營養代謝纖毛病的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒大腸桿菌 （Escherichia coli）XL1-blue，BL21（DE3）感受態細胞，pET-28a（+）質粒：均為作者所在實驗室保存；萊茵衣藻CC-125 藻種：為作者所在實驗室保存。

1.1.2 主要試劑限制性內切酶、TransTaqHiFi DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶和彩色預染蛋白Marker等：均購自美國Fermentas 公司；質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、PCR 產物純化試劑盒、NC 膜：購自北京索來寶公司；DNA Marker（1000 bp、100 bp）、dNTPs：購自全式金公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow 蛋白質純化介質以及Protein A SepharoseTMCL-4B 抗體純化介質： 均購自美國GE Healthcare 公司；弗式完全佐劑和不完全佐劑：購自美國Sigma 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG 抗體：購自美國Cell Signaling 公司。

1.1.3 實驗動物新西蘭大白兔1 只， 兩月齡大，體重1.5 kg，由天津歐陽實驗種兔場提供。

1.2 方法

1.2.1 IFT57 蛋白質親水性分析運用DNAMAN軟件對IFT57 表達蛋白質進行親水性分析，見圖1。選取N 端319~469 aa 作為抗原，在大腸桿菌中進行表達[13]。

圖1 IFT57 表達蛋白質的親水性分析Fig. 1 Hydrophilic analysis the expressed of IFT57 protein

1.2.2 原核表達載體構建作者所在實驗室保存的pET-28a （+） 表達載體用BamHI、HindIII 進行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行純化回收；根據引物設計原則設計帶有BamHI 和HindIII 酶切位點的PCR 引物，上游引物5’-TAGGATCCATGGTGAT CAGCA AGGCCTGG-3’，下游引物5’-ACAAGCTT TCA CTA GTCCTCCTCCTCGTCG-3’。 通 過 菌 落PCR 擴增目的片段，利用產物純化試劑盒回收擴增產物。用BamHI、HindIII 進行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目的基因；將目的基因與載體用T4DNA 連接酶連接后， 轉化到大腸桿菌XL1-blue 中，涂到含卡那霉素（50 μg/mL）的LB 平板上；挑選陽性菌落進行培養，提取重組質粒，進行酶切和測序驗證。

1.2.3 重組質粒在大腸桿菌中誘導表達驗證將驗證正確的重組質粒用熱激法轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中，在含卡那霉素（50 μg/mL）的LB 平板上篩選含pET-28a（+）-ift57質粒的陽性菌落；挑取陽性菌落于LB 液體培養基（含50 μg/mL 卡那霉素）過夜培養，然后按照1∶20 接種體積分數轉接擴大培養到含卡那霉素（50 μg/mL）的LB 培養基中，37 ℃、225 r/min 培養至OD600值到0.6~0.8， 加入終濃度0.2 mmol/L 的IPTG，28 ℃、200 r/min 誘導表達6 h，同時設置不加IPTG 對照組。 離心收集菌體并進行超聲破碎，分別取未誘導、全蛋白質、上清液和沉淀與2×蛋白質上樣緩沖液混合煮沸， 用12 g/dL SDS-PAGE 電泳檢測蛋白質表達情況。

1.2.4 融合蛋白質6×His-IFT57 的純化誘導表達后的菌體加入15 mL His Bingding buff （20 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH 7.4），超聲破碎菌體細胞至澄清，離心（4 ℃，12 000 r/min，15 min）收集上清液，經過0.45 μm 濾膜過濾后加入到預先平衡好的Ni SepharoseTM 6 Fast Flow 純化柱中，經過常溫結合、洗滌和洗脫等步驟得到純化后的目的蛋白質。純化條件為：常溫結合1 h，洗滌緩沖液A（20 mmol/L咪唑，20 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH 7.4），洗脫緩沖液A（500 mmol/L 咪唑，20 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH 7.4），將上述收集的流穿液組分、洗滌組分以及洗脫組分分別用12 g/dL SDS-PAGE檢測分析，利用酶標儀，結合標準曲線測定融合表達蛋白質濃度[14]。 通過不斷優化所用溶液的pH、鹽離子濃度、咪唑的含量等條件得到了純度較高的融合蛋白質。

1.2.5 多克隆抗體的制備實驗動物是兩月齡大的新西蘭雄性大白兔， 適應一周后進行第一次免疫。 初次免疫前在耳源靜脈取血，分離血清，在后續試驗中作為陰性血清[15-16]；取1 mg 純化后的融合蛋白質與同劑量弗氏完全佐劑混合后充分乳化，采用頸背部皮下多點注射法免疫實驗動物； 之后每隔10～14 d 取1 mg 6×His-IFT57 蛋白質與同劑量的弗氏不完全佐劑進行乳化，加強免疫大白兔，每次加強免疫前進行耳源取血，利用間接ELISA 法測定抗血清的效價，當效價滿足試驗要求，加強免疫后一周取血分離抗血清，分裝凍存[17-18]。

1.2.6 間接ELISA 法測定抗血清效價本實驗采用間接ELISA 法測定抗血清的效價， 以6×His-IFT57 蛋白質作為包被抗原，用5%的脫脂乳粉封閉后，以所得的抗血清為一抗，抗血清和陰性血清設定稀釋梯度1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000，二抗為HPR 標記的山羊抗兔IgG（1∶10 000），經過TMB（3′，3′，5′，5′，-四甲基聯苯胺）顯色并經0.5 mol/L H2SO4終止，測定OD450處的吸光值，對照實驗組血清OD450與陰性組血清OD450的數值，確定抗血清的效價[19]。

1.2.7 抗血清的純化分離完的抗血清用Protein A SepharoseTM進行純化，純化條件為[12]：結合緩沖液B（12 mmol/L Na2HPO4，8 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0），洗脫緩沖液B（0.1 mol/L 甘氨酸，pH 2.7）。收集洗脫液，用1 mol/L Tris-HCl（pH 9.0）將洗脫液pH 值調至中性，進行后續Western blotting 檢測。

1.2.8 Western blotting 檢測多克隆抗體的特異性將處理好的萊茵衣藻CC-125 藻種進行蛋白質定量[20]，取8 μL（20 ng）衣藻上清液加入2 μL 5×上樣緩沖液混勻，進行SDS-PAGE 和電轉印后，衣藻蛋白質轉移到PVDF 膜上， 用5%的脫脂奶粉封閉1 h；多克隆抗體稀釋度1∶500，二抗為HRP 標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000），加入顯色液后曝光照相。

2 結果與分析

2.1 原核表達載體的構建及鑒定

PCR 擴增獲得456 bp 片段， 與預期大小一致，見圖2（a）。 將重組的質粒進行BamHI 和HindIII 雙酶切驗證， 獲得條帶大小約為450 bp 左右的片段，與預期結果一致，見圖2（b）。 將重組質粒送到金唯智公司測序，經過測序驗證后序列完全正確，說明表達載體構建成功，表達質粒結構正確，并將其命名為pET-28a（+）-ift57。

圖2 ift57 的PCR 擴增和重組表達載體的雙酶切驗證Fig. 2 PCR amplication of ift57 and identification of recombinant expression plasmid by restriction enzyme digestiond

2.2 融合蛋白質的誘導表達及可溶性分析

pET-28a （+）-ift57轉 化 到 大 腸 桿 菌BL21（DE3）中，菌體經過0.2 mmol/L IPTG 誘導（同時設置不含IPTG 的對照組），經過SDS-PAGE 在17 200處出現目的條帶， 對照組菌體蛋白質沒有此帶，說明目的蛋白質6×His-IFT57 成功表達， 見圖3（a）；將誘導完的菌體經過超聲破碎，取全蛋白質和上清液以及沉淀，經過SDS-PAGE 發現，目的條帶主要出現在上清液中，而沉淀中則幾乎沒有，說明融合蛋白質呈水可溶性，見圖3（b）。

圖3 SDS-PAGE 檢測重組蛋白質在E. coli BL21（DE3）中的表達Fig. 3 SDS -PAGE analysis of the expression of recombinant protein in E. coli BL21（DE3）

2.3 融合蛋白質的純化

融合蛋白質6×His-IFT57 經過His 親和層析純化后，用SDS-PAGE 進行分析。結果表明，融合蛋白質的相對分子質量大小正確， 且純度達95%以上，見圖4。

2.4 抗血清效價的測定

用純化得到的6×His-IFT57 融合蛋白質作為抗原免疫新西蘭大白兔，第五次免疫后經耳緣靜脈少量采血， 室溫靜置1 h 后獲得析出血清， 以間接ELISA 法測定抗血清的效價，利用酶標儀測定OD450處的吸光值后計算出抗血清的效價，結果見圖5?？芍?，新西蘭大白兔抗血清效價大于512 000。

圖4 經Ni SepharoseTM 6 Fast Flow 純化后6×His-IFT57融合蛋白質的SDS-PAGE 檢測Fig. 4 SDS-PAGE analyzed the purified 6×His-IFT57 recombinant protein

圖5 間接ELISA 法測定抗血清的效價Fig. 5 Results of ELISA test of anti-IFT57 polyclonal antiserum

2.5 Western blotting 抗體特性檢測

于第五次免疫后一周取兔子血分離抗血清。 將抗血清首先經過Protein A 純化， 再進行抗原-抗體膜純化。 用Western blotting 檢測其識別萊茵衣藻中IFT57 蛋白質的特異性，經過顯色可以在57 000 附近識別出單一條帶，條帶相對分子質量大小符合預期， 見圖6。 即制備的多克隆抗體可以特異性識別IFT57 蛋白質，可以直接用于后續對IFT57 的研究。

3 結 語

目前對纖毛的結構、組裝機制、功能的研究和對“纖毛相關疾病”相關機理的了解主要來自于對萊 茵 衣 藻、 四 膜 蟲 （Tetrahymean）、 錐 體 蟲（Trypanosome）、 線 蟲 （C. elegans）、 斑 馬 魚（Brachydaniorerio）和小鼠（Musmusculus）等各種模式生物的研究。 萊茵衣藻以其特有的細胞培養優勢、實驗系統優勢、生化研究優勢和經典遺傳優勢等成為研究最廣的一個[21]。目前，對纖毛的研究起步較晚，我們對“纖毛內運輸”調控機制、馬達蛋白的活性調劑，以及纖毛解聚和細胞周期之間的相互關系等認識有限，對“纖毛相關疾病”的發病機理的研究，以及對該類病的預防、診斷和治療還有一定差距[21-22]。 因此，繼續對“纖毛內運輸”中不同蛋白質顆粒的研究，將會給這些問題帶來答案，對“纖毛相關疾病”機理的研究和預防治療，帶來一定的理論基礎和指導意義。

本研究的ift57基因，雖然在對纖毛的形成中不起重要作用，但是在阻礙纖毛降解過程中發揮重要作用，從而避免了纖毛的缺失[10]。為進一步研究ift57基因對纖毛缺失的影響，我們制備了高特異性和高靈敏度的抗體。 作者利用大腸桿菌，經原核表達系統表達ift57部分親水性序列，采用小標簽His 純化標簽和目的蛋白質融合表達出純度極高（95%以上）的可溶性蛋白質，作為抗原免疫動物獲得相應抗血清。 該抗體靈敏度強、特異性高，僅經過一步純化便可以經過ECL 曝光， 充分驗證其特異性和靈敏度。該方法極大的節省了融合蛋白質純化和抗血清純花步驟，帶來了一定經濟效益。 該方法為多克隆抗體的制備提供了一種新型手段， 為大相對分子質量、水不溶性蛋白質的純化提供了借鑒意義。 該抗體的制備為ift57 在纖毛運輸的作用機制和有關纖毛病的研究提供了有利的支持。

圖6 Western blotting ECL 曝光法驗證IFT57 抗體特異性Fig. 6 IFT57 antibody specificity was detected by Western blotting through ECL method