亞鐵離子和吲哚丁酸促進裂殖壺菌產DHA及發酵驗證

李亞妃， 趙 犇， Martha Daniel Mbifile， 楊海麟， 王 武*

（1． 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2. 江南大學 工業微生物教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

二十二碳六烯酸 （docosahexenoic acid， 簡稱DHA），屬于ω- 3 型長鏈多不飽和脂肪酸，對嬰兒視力發育和兒童智力發育起重要作用， 對高血壓、關節炎、成人糖尿病、抑郁、動脈粥樣硬化、血栓形成和某些癌癥有預防效果[1-5]。 作為DHA 生產菌株，裂殖壺菌（破囊壺菌科，Schizochytriumsp.）生長快，產油高，DHA 含量高， 菌體是一種安全的食品添加劑，已成為工業化生產DHA 的優秀菌種之一[6-10]。無機鹽中的金屬離子是微生物體內一些酶的輔基，參與調節酶的結構和活性，調節細胞膜通透性，對于屬于海洋真菌的裂殖壺菌有明顯影響[11]。 生長素是一類能以極低的濃度來調節植物的生理過程的微量活性物質，對破囊壺菌（T. roseumMF2 ）和裂殖壺菌的生長和產DHA 有很大影響[12-13]。作者首先分別研究了無機鹽和生長素類植物激素對裂殖壺菌生長和產油的影響， 確定FeSO4對裂殖壺菌的生長有顯著促進作用，吲哚乙酸（Indolebutyric acid，簡稱IBA）則對裂殖壺菌生長和產DHA 有明顯提高。 在此基礎上進行了FeSO4和IBA 的兩因素、三水平的響應面中心組合試驗設計， 旨在探究FeSO4和IBA的組合添加對裂殖壺菌生長、 產油和DHA 含量的影響，得到組合添加FeSO4和IBA 培養裂殖壺菌產DHA 的最佳培養方案。 最后在7.5 L 發酵罐中分別進行了對照組和優化后發酵策略的放大實驗，探究FeSO4和IBA 對裂殖壺菌發酵周期中各階段的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種

裂殖壺菌Schizochytruimsp.AB-610，由作者所在實驗室ARTP 誘變獲得， 于-40 ℃保存于20%甘油管中。

1.2 培養基

種子培養基：30 g/L 葡萄糖，10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，溶于50%人工海水中。 人工海水配方由作者所在實驗室在基礎上優化所得：11 g/L NaCl，0.8 g/L KCl，1.22 g/L MgCl2，0.71 g/L CaSO4，0.93 g/L MgSO4。

發酵培養基：100 g/L 葡萄糖，4 g/L 胰蛋白胨，18 g/L MgSO4，20 g/L 谷氨酸鈉，2.5 g/L KH2PO4，0.4 g/L CaCl2，蒸餾水與人工海水按體積比1∶1 混合。

1.3 培養方法

1.3.1 搖瓶種子培養接種1 mL 甘油管菌種于種子培養基中，200 r/min、28 ℃下培養48 h 為一級種子液。將一級種子液以10%接種體積分數接入100 mL 種子培養基中，200 r/min、28 ℃下培養24 h 為二級種子液。

1.3.2 搖瓶發酵方法將一級種子液以10%接種體積分數接入100 mL 發酵培養基中，200 r/min、28 ℃下培養5 d。

1.3.3 補料分批發酵方法將二級種子液以10%接種體積分數接入載有3 L 發酵培養基的NBS110型7.5 L 發酵罐中， 中后期維持葡萄糖質量濃度在一定范圍內，調控pH 為6.8，400 r/min、28 ℃下培養5 d，進行補料分批發酵。

1.4 測定方法

1.4.1 菌體干質量測定取10 mL 發酵液于已稱質量的離心管中，于8 000 r/min 離心15 min，棄上清液，再以去離子水清洗菌體，置于60 ℃干燥箱中烘干至恒質量，稱質量。

1.4.2 裂殖壺菌油脂提取取20 mL 發酵液于旋塞離心管中，于8 000 r/min 離心15 min，棄上清液，再以去離子水清洗菌體。 以去離子水定容至5 mL，加入8 mL 鹽酸，加入玻璃珠混勻，70 ℃水浴2 h。加入20 mL 正己烷，混勻，取上層有機層于已稱質量的蒸餾瓶中，于55 ℃真空旋轉蒸發至恒質量，稱質量。

1.4.3 油脂中脂肪酸組成測定脂肪酸甲酯化及脂肪酸組成測定參照文獻[9]。

縱觀張岱家族，從張天復、張元忭經過張汝霖到張岱，都十分欣賞徐渭的才學。從送馬金囊、短袖皮襖和菽酒，鼎力幫其出獄，到編寫《會稽縣志》，天復、元忭父子主要通過生活上、行動上體現了對徐渭的關愛，而張汝霖、張岱祖孫倆，則通過寫文輯書的方式表達了他們對徐渭的敬意。

1.4.4 發酵液中葡萄糖質量濃度測定取發酵液1 mL，于8 000 r/min 離心15 min

，取上清液用去離子水稀釋至適當質量濃度， 利用SBA-40B 型生物傳感分析儀測定葡萄糖質量濃度。

2 結果與討論

2.1 無機鹽分別對Schizochytruim sp.AB-610 生長和產DHA 的促進作用

分別選擇了ZnSO4、MnCl2、FeSO4進行實驗，三組實驗所得結果中以生物量為標準所確定的最優添加量及其對應的發酵結果見表1。

表1 ZnSO4、MnCl2、FeSO4 對Schizochytruim sp.AB-610 生長和產油的影響Table 1 Effects of ZnSO4、MnCl2、FeSO4 on DCW/lipids/DHA in Schizochytruim sp.AB-610

ZnSO4抑制了Schizochytruimsp.AB-610 生長，在添加了ZnSO4的實驗中， 菌體生物量下降了10.7%，油脂產量和DHA 產量亦有所下降。Zn2+對包括糖酵解途徑中的一些重要酶促反應有抑制[14]，推測可能是Zn2+影響了Schizochytruimsp.AB-610 中的能量代謝，從而影響了細胞的生長和產油。

MnCl2對細胞生長和DHA 產量無明顯影響，而對胞內油脂產量有所抑制， 使得油脂內DHA 質量分數提高了10.6%。 根據MnCl2組實驗數據分析發現添加量在24~48 mg/L 時， 胞內油脂含率逐漸降低，而油脂內DHA 質量分數逐漸提高。 裂殖壺菌利用NADPH 和乙酰輔酶A 通過不同的代謝途徑合成飽和脂肪酸和與多不飽和脂肪酸（DHA、DPA、EPA）[15]?；诖?，作者推測Mn2+對Schizochytruimsp.AB-610中飽和脂肪酸的合成有明顯抑制作用，而對其多不飽和脂肪酸的合成無明顯影響。

FeSO4對細胞的生長有顯著促進作用， 添加量為1 mmol/L 時菌體生物量較對照組提高了35.7%，FeSO4組實驗結果見圖1。 通過分析發現，FeSO4對細胞生長和產油的促進作用不同步，1 mmol/L 時對細胞的促進最大， 而在1.5 mmol/L 油脂內DHA 質量分數促進最大，為46.13%，此時生物量為41.03 g/L。

圖1 FeSO4 對裂殖壺菌生長和產油的影響Fig. 1 Effect of FeSO4 on biomass，lipids，DHA in Schizochytruim sp.AB-610

基于此，可在后期利用裂殖壺菌發酵周期中發酵特性的變化開展分階段補加Fe2+的研究。Fe2+作為輔基參與多種酶促反應， 而其對Schizochytruimsp.AB-610 生長的高效促進作用可能是由于其參與了細胞生長、產油中的某些代謝途徑，促進了能量代謝。 后續可通過分子生物學手段如轉錄組學等方法進行Fe2+高效促進Schizochytruimsp.AB-610 細胞生長的機理研究。

2.2 生長素對Schizochytruim sp.AB-610 生長和產油的影響

分別選擇了吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）進行實驗，三組實驗所得結果中以生物量為標準所確定的最優添加量及其對應的發酵結果見表2。

萘乙酸為類生長素，可促進植物細胞分裂與擴大。 實驗結果表明，它對Schizochytruimsp.AB-610的生長有一定促進作用，在添加量為1 mg/L 時生物量達到最大，為37.35 g/L，較對照組提高了13.6%。實驗同時表明，NAA 對細胞產油和產DHA 產量并無明顯影響。

吲哚丁酸對Schizochytruimsp.AB-610 的生長和產油均有明顯促進作用，添加量為7 mg/L 時生物量、油脂產量和DHA 產量均達到最大值，結果見圖2。推測IBA 不僅促進了細胞的增殖和生長，同時與胞內多不飽和脂肪酸合成途徑中的相關酶系有影響，促進了多不飽和脂肪酸的合成，從而提高了胞內油脂中的DHA 質量分數，后續將選擇IBA 進一步研究。

表3 中心試驗設計與結果Table 3 Experiment design and results of center composite design

2.3 促進因子應用于發酵的響應面法優化

在單因素實驗中裂殖壺菌的生物量、油脂產量和油脂中DHA 的質量分數有所提高。 為了進一步提高DHA 生產水平， 在單因素研究的基礎上，以FeSO4、IBA 的最佳點作為中心點，在500 mL 搖瓶中進行兩因素、 三水平的響應面優化實驗， 利用Design -Expert.V8.0.6.1 軟件中Center Composite Design 進行實驗設計。 設計因素包括A：FeSO4添加濃度、B：IBA 添加質量濃度，因變量包括DCW、油脂產量、DHA 產量，實驗方案與結果見表3。

利用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件分別對油脂產量和DHA 產量進行回歸分析與擬合。 油脂產量的回歸模型及方差結果見表4。 模型的F=19.9，P=0.000 5。 一般認為當P值小于0.05 時， 模型顯著，因此該模型顯著。模型失擬項F=1.28，P=0.408 9。一般認為P值大于0.05 時，不顯著，因此模型失擬項 不 顯 著。 模 型 中B、AB、AC和A2的P值 小 于0.05，說明這些因素顯著，A的P值大于0.1，說明不顯著。 多元二次回歸模型為：

油脂產量=-1.473 63+20.504 67*FeSO4+2.919 09* IBA-10.037 47 *FeSO42-0.244 63*IBA2

表4 油脂產量二次響應面回歸模型方差分析Table 4 Analysis of Variance for quadratic response surface regression model of the lipids yield

DHA 產量的回歸模型及方差結果見表5。 模型的F=25.82，P=0.000 1。該模型顯著，失擬項不顯著。模型中B、AB、AC和A2的P值小于0.05，說明這些因素顯著，A的P值大于0.1，說明不顯著。 多元二次回歸模型為：

DHA 產量=-2.917 66+10.660 87* FeSO4+1.887 51*IBA-5.280 94* FeSO42-0.148 83*IBA2

通過所獲模型方程對油脂產量和DHA 產量進行整理，得到A：0.95 mmol/L，B：6.5 mg/L，細胞生物量為模型預測值為48.38 g/L， 油脂產量17.59 g/L，DHA 產 量8.43 g/L， 油 脂 中DHA 質 量 分 數 為47.9%。 在該條件下進行三次平行試驗，實驗結果為生物量（49.23±0.25） g/L，油脂產量（17.73±0.13） g/L，DHA 產量（8.11±0.23） g/L，油脂中DHA 質量分數（47.6±0.2）%。 實驗結果與預測值相吻合，見圖3。

2.4 添加促進因子后裂殖壺菌發酵的特性

2.4.1 對照組中裂殖壺菌細胞形態變化走勢裂殖壺菌生殖方式包括二分裂生殖、孢子生殖和異形體增殖， 作者所在實驗室菌株Schizochytruimsp.AB-610 以連續二分裂為主要生殖方式[14]。 在NBS 7.5 L 發酵罐中補料分批發酵下培養Schizochytruimsp.AB-610 5 d，初始裝液量3 L，接入體積分數10%預培養的種子液，28 ℃、通氣量3 vvm，pH 6.8 條件下對裂殖壺菌進行發酵培養，48 h 開始補加一定葡萄糖， 維持葡萄糖質量濃度在40～50 g/L， 觀察Schizochytruimsp.AB-610 發酵周期中各分裂形態細胞（單細胞、二分體、四分體、八分體、多分體和成團細胞）的比例，確定裂殖壺菌發酵周期中細胞所處的時期。

表5 DHA 產量二次響應面回歸模型方差分析Table 5 Analysis of Variance for quadratic response surface regression model of the DHA yield

發酵前期，分裂形態細胞占據主體。 二分體比例在6 h 時達到峰值47.4%， 之后八分體細胞則占據主體地位，12～24 h 時， 八分裂細胞比例維持在57%～64%。 單細胞比例在前期（6～18 h）有所下降，在18 h 達到最低值11.1%，中后期則持續上升。 中期分裂形態細胞比例開始下降，單細胞比例持續增高，至66 h 時，單細胞比例超過50%。后期各形態細胞趨于穩定，細胞基本停止分裂活動。 作者在觀測時未計入異形體、孢子囊等其他增殖方式的細胞形態，見圖4。

圖3 Center Composite Design 實驗設計下Schizochytruim sp.AB-610 發酵響應面Fig. 3 Results of fermentation of Schizochytruim sp.AB-610 with Center Composite Design

圖4 裂殖壺菌發酵周期中各形態細胞比例的變化Fig. 4 Ratio of different morphologic cells during fermentation of Schizochytruim sp.AB-610

由此說明裂殖壺菌發酵過程中，前期菌體以分裂細胞形態為主，細胞快速分裂；中期細胞開始分離，細胞開始變大，逐漸轉入產油期，多細胞形態比例減少，細胞分裂速度減慢，至后期細胞基本穩定，無明顯形態變化。

2.4.2 裂殖壺菌發酵特性在NBS 7.5 L 發酵罐中補料分批發酵條件下培養Schizochytruimsp.AB-610 5 d，發酵策略同上，每隔12 小時取樣，測發酵液中葡萄糖、生物量、油脂產量、油脂中脂肪酸組成。 對照組及添加促進因子后的發酵特性曲線見圖5。

分析對照組發酵特性曲線，Schizochytruimsp.AB-610 的補料分批發酵周期中，1） 生物量變化規律：0~24 h 內，菌體量增長緩慢，碳源消耗速率小，24~72 h 菌體量快速增長， 特別在24~48 h 內對碳源的細胞得率（YX/S）最大，細胞平均生長速率為1.19 g/（L·h），80 h 時生物量達到64.6 g/L， 之后生物量緩慢下降。2）油脂含率變化規律：12~48 h 內菌體內油脂含率緩慢下降，而在48~96 h 內迅速上升，96 h時達到最高值40.5%， 之后至發酵結束期間內緩慢下降。 發酵伊始生物量和油脂產量均較低，所得油脂含率誤差較大，此處并未分析。 3）油脂內DHA 質量分數：油脂中DHA 質量分數在12~60 h 內持續降低，在60~120 h 內持續緩慢上升，至發酵結束時達到41.13%。至發酵結束時，菌體生物量為64.06 g/L，菌體內油脂含率38.9%， 油脂中DHA 質量分數為41.13%。

結合發酵周期中細胞形態變化趨勢，0~24 h內，菌體快速分裂，但代謝速率低，細胞個體仍較小，生物量上升緩慢。 24~48 h 內，細胞仍處于旺盛分裂時期，碳源消耗速率高，細胞得率高，生物量快速增長，細胞數量和個體均處于增長時期。 48~96 h內，細胞二分裂活動逐漸減緩，開始快速積累油脂，且在前期（48~72 h）以合成飽和脂肪酸為主。96~120 h菌體量和細胞活動都趨于穩定，葡萄糖消耗速率和比消耗速率下降， 菌體消耗了自身的一部分油脂，且偏好于消耗飽和脂肪酸。 依據上述特點確定：Schizochytruimsp.AB-610 的補料分批發酵周期中，0~24 h 為菌體適應期，24~48 h 為菌體快速生長期，48~96 h 為油脂快速積累期，96~120 h 則為油脂返耗期。

圖5 Schizochytruim sp.AB-610 發酵特性曲線對照組、添加了促進因子組Fig. 5 Fermentation characteristic curve of Schizochytruim sp.AB-610 with control supply FeSO4&IBA

添加促進因子的補料分批發酵中，菌體適應期（0~24 h）， 添加雙促進因子的試驗組與對照組并無明顯區別。 快速生長期（24~48 h），雙促進因子的添加有效促進了菌體的生長，試驗組的生長速率達到1.51 g/（L·h），較對照組提高了26.7%，至快速生長期結束，試驗組的生物量達到49.23 g/L。 油脂積累期（48~96 h）， 試驗組細胞的油脂含率略低于對照組，分析原因可能是生物量的提高更多地消耗了培養基中營養元素和溶氧等，一定程度上限制了胞內油脂積累。48~84 h 為產油旺盛期，試驗組的油脂積累速率為0.604 g/（L·h），高于對照組的0.454 g/（L·h），這依賴于試驗組更高濃度的菌體。 產油期結束時，試驗組油脂中DHA 為41.5%，高于對照組，說明雙促的添加有利于細胞中DHA 的合成。 油脂返耗期（96~120 h），生物量至108 h 時仍有微弱增長，達到最高值93.03 g/L，說明雙促的添加延長了菌體的生長期，后期試驗組生物量消耗較對照組大，這可能是試驗組生物量基數較大引起的。 至發酵結束時，添加雙促進因子的補料分批發酵生物量、 油脂產量、DHA 產量分別為90.56、35.42、15.52 g/L。 DHA生產強度為3.10 g/（L·d），得到了有效提高。

雙促進因子的添加可有效地提高Schizochytruimsp. AB-610 快速生長期的生長速率，促進產油期DHA 的合成，對DHA 的產量和生產強度有大幅提高，證明雙促進因子的添加對高密度發酵產DHA 同樣有顯著促進。 同時，本研究并未將發酵技術復雜化，有利于放大生產，同時與其他技術手段相結合， 進一步提高高密度發酵的生產水平，有望提高大規模發酵產DHA 的生產強度。

3 結 語

作者確定了FeSO4可高效促進Schizochytruimsp.AB-610 的 生 長，IBA 對Schizochytruimsp.AB-610 生長和產DHA 均有促進，并利用中心組合實驗設計確定了兩種促進因子組合添加的最適添加量為FeSO40.95 mmol/L，IBA 6.5 mg/L，搖瓶驗證試驗中較對照組生物量提高了50.01%，DHA 產量提高了65.17%。 通過初步放大發酵試驗證明，添加兩種促進因子高效促進了菌體生長，提高了快速生長期細胞的生長速率，延長了菌體增長的時期，至發酵結束時生物量為90.56 g/L， 油脂產量為35.42 g/L，DHA 產量為15.52 g/L， 較對照組均有明顯提高，且DHA 的生產強度提高了51.22%。