篩選特異性抑制釀酒酵母產孢的人類基因

殷 政， 中西秀樹， 李子杰， 張慧杰， 藤田盛久*， 高曉冬

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

酵母與哺乳動物細胞同為真核生物，二者具有很多相似的結構，將酵母作為研究人類基因的工具具有巨大的優勢。 酵母細胞遺傳背景清晰、培養簡單、基因操作技術成熟完備，極大降低了哺乳動物細胞各種復雜的生理過程對蛋白質研究的干擾。1987 年，Lee 和Nurse[1]在裂殖酵母中表達了人類cDNA， 篩選得到能回補裂殖酵母cdc2Δ 缺陷的直系同源蛋白質，證明人類細胞中具有與真菌細胞周期基因CDC2 相同功能的基因。該實驗表明，利用酵母作為篩選人類基因的工具并對基因功能進行研究具有廣泛的應用前景及巨大的研究價值。 此外，實驗室之前的研究[2]將酵母SSO1 的SNARE 區域替換為人源syntaxin1A， 通過突變分析得到回補產孢的突變體， 發現218 位谷氨酸殘基為SSO1 產孢功能所必須，并且為篩選與syntaxin1A 作用的蛋白質或藥物提供了更為簡便的方法，同時表明人類的某些基因確實可以參與產孢過程中的某些環節并對其產生影響，并且可以對該基因功能研究和對酵母產孢過程的徹底研究帶來新的進展和突破。

釀酒酵母二倍體細胞在缺乏氮源且存在非發酵型碳源的條件下， 為了應對營養匱乏的不利環境，營養細胞停止生長[3]，進入減數分裂過程并產生4 個單倍體細胞核[4-5]。 隨后細胞質膜通過高爾基體分泌囊泡（post-Golgi secretory vesicles）重新定位在紡錘體極體 （spindle pole bodies）， 形成前孢子膜（prospore membrane）且不斷延伸，最后前孢子膜閉合形成未成熟的孢子[6-8]。 接著在前孢子膜的表面進行孢子壁的組裝，孢子壁組裝完成標志著成熟孢子的形成。 孢子壁具有四層結構，從里到外分別是甘露糖層、β-葡聚糖層[9]、殼聚糖層和二酪氨酸層[10]，其中二酪氨酸層作為孢子形成過程的最后一環，同時賦予孢子抵御外界環境壓力的能力[11-13]。 由于二酪氨酸層的存在，孢子在10%的氨水緩沖液下使用UV 照射具有自熒光特性[12]。

釀酒酵母的產孢過程雖然并不存在于哺乳動物細胞中，但該過程中發生的很多細胞活動在真核細胞中都存在保守性。 基因組測序表明，酵母有大量的基因與人類同源[14]，尤其是基本細胞代謝及分裂有關的基因存在著高度的基因保守性[15-17]。 人體中重要的蛋白質很多都是在酵母中先被發現其同源物，其中包括有關細胞周期的蛋白質、信號蛋白質和蛋白質加工酶等[18]。

本研究建立了一個篩選特異性抑制釀酒酵母產孢過程的人類基因的方法，使用實驗室構建的帶有人類基因的酵母表達質粒pRS426-TEFprgeneX，在二倍體釀酒酵母中表達單獨的人類基因。利用二酪氨酸層具有自熒光特性，通過實驗證明孢子的相對熒光強弱可以直接反映產孢率的高低，將相對野生型孢子的熒光強弱作為釀酒酵母產孢過程是否發生抑制的判斷標準，篩選出不影響酵母營養細胞生長的同時能特異性抑制產孢過程的人類基因，并進行初步的研究。 篩選獲得的候選基因極大可能涉及細胞營養敏感性、減數分裂以及膜運輸重組這些產孢過程中發生的細胞活動，同時哺乳動物細胞中這些相關的功能和調節機制尚未完全清楚，具有極大的研究價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒釀酒酵母AN120 野生型菌株、dit1Δ 缺陷型菌株、AN117-4B 野生型菌株、 大腸桿菌T1 噬菌體抗性菌株、 大腸桿菌DH5α 以及質粒相關信息見表1。

1.1.2 培養基LB 培養基：酵母提取物10 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，純化瓊脂粉20 g（固體培養基）， 用去離子水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min后使用。

SD-Ura 培養基：無氨基酵母氮源（YNB） 6.7 g，純化瓊脂粉20 g（固體培養基），用去離子水定容至900 mL，121 ℃高壓滅菌20 min，使用前分別加入2 g 缺少尿嘧啶（Uracil）的氨基酸混合物與100 mL 已滅菌的20%的葡萄糖溶液。

YPAD 培養基：酵母提取物10 g，蛋白胨A 20 g，腺嘌呤硫酸鹽30 mg， 用去離子水定容至900 mL，121 ℃高壓滅菌20 min， 使用前加入100 mL 已滅菌的20%的葡萄糖溶液。

YPACe 培養基：酵母提取物10 g，蛋白胨A 20 g，醋酸鉀20 g，腺嘌呤硫酸鹽30 mg，用去離子水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。

產孢培養基：醋酸鉀20 g，純化瓊脂粉20 g（固體培養基），用去離子水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min 后使用。

1.2 實驗方法

1.2.1 pENT221 entry vector 提取在提前滅菌過的10 mL 離心管中加入2 mL 含有Kan 抗性的LB液體培養基， 將保存有人cDNA 文庫的96 孔板從-80 ℃冰箱中取出， 冰上靜置10 min， 每孔吸取10 μL 菌液接入含有Kan 抗性的LB 液體培養基中，37 ℃、220 r/min 過夜培養。 離心收集所有菌體，使用生工購買的SanPrep 柱式質粒DNA 小量抽提試劑盒提取質粒，并于-20 ℃下保存。

1.2.2 酵母表達質粒的構建由于作者所在實驗室購買的人cDNA 文庫原始克隆載體無法在釀酒酵母中表達，所以為了能在釀酒酵母中表達人類基因用于篩選，本研究構建了含有attL1/2 交換序列的pRS426-TEFpr destination vector，與含有人類cDNA和attR1/2 交換序列的原始克隆載體pENT221 entry vector 進 行LR 重 組 反 應， 在 室 溫 下 將1～7 μL pENT221 entry vector （50 ～150 ng/μL） 與1 μL pRS426-TEFpr destination vector（150 ng/μL）在離心管里混合， 用pH 8.0 的TE Buffer 補齊至8 μL。 將LR Clonase II enzyme mix 從-20 ℃取出，冰上靜置2 min，短暫振蕩LR Clonase II enzyme mix 兩次。 每個樣品 （除了陰性對照） 加入2 μL LR Clonase II enzyme mix，兩次短暫振蕩混勻，25 ℃反應1 h。 反應結束后對每個反應加入1 μL 蛋白酶K 溶液，37 ℃反應10 min，轉化1～2 μL 反應產物進入DH5α 大腸桿菌宿主，涂布在kan 抗性的LB 平板上，37 ℃過夜培養。

1.2.3 重組質粒的驗證挑取轉化得到的單個轉化子，接入2 mL Kan 抗性的LB 液體培養基中，37 ℃、220 r/min 過夜培養。 離心收集所有菌體，使用生工購買的SanPrep 柱式質粒DNA 小量抽提試劑盒提取質粒，根據購買cDNA 文庫所附帶的對應人類基因序列， 找出每個重組質粒內具有的BamH I 和EcoR I 限制性酶切位點的位置和數量。 用10 μL 酶切體系 （1 μL 重組質粒，1 μL 10×K Buffer，0.1 μL BamH I，0.1 μL EcoR I，7.8 μL ddH20）在37 ℃反應2 h，核酸電泳（120 V，20 min，1 000 maker）驗證重組質粒是否正確。

表1 本研究使用的菌株與質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2.4 檢測不同產孢率的釀酒酵母在UV 下的熒光強度為了檢測產孢率與UV 照射下熒光強度的關系，利用單倍體酵母無法產孢的特性，將雙倍體釀酒酵母AN120 與單倍體釀酒酵母AN117-4B 按照不同比例混合，經過產孢培養從而形成高低不同的產孢率。 將雙倍體和單倍體野生型釀酒酵母分別接種到5 mL YPAD 液體培養基中，過夜培養，通過測定OD660調整AN120 與AN117-4B 的菌液至相同濃度，按照2∶8，5∶5，8∶2 的比例混合兩種菌液，分別取20 μL 點在YPAD 固體培養基上，置于30 ℃恒溫培養箱中培養16 h。 將已滅菌的中速定性濾紙貼合在新的YPAD 固體培養基上，影印之前點板培養得到的菌落，使得酵母菌株影印到濾紙上，置于30 ℃恒溫培養箱中培養8 h。 將濾紙以及濾紙上的釀酒酵母菌落一并轉移到產孢固體培養基上， 置于30 ℃恒溫培養箱中培養24 h。 取出濾紙浸潤在10%的氨水緩沖液中并置于干凈透明的塑料器皿中，使用凝膠成像儀拍攝UV 下的熒光照片，使用Image J 軟件處理圖片并測定熒光強度。 同時挑取菌落重懸在無菌水中，顯微鏡下統計釀酒酵母營養細胞和孢子球的數量，計算產孢率。

1.2.5 重組質粒轉化到釀酒酵母接種釀酒酵母AN120 到5 mL YPAD 培養基（試管）中，30 ℃、220 r/min培養10 h， 轉接1 mL 菌液到80 mL 液體YPAD 培養基（250 mL 三角瓶）中，30 ℃、220 r/min 過夜培養至OD660在1.2~1.6 之間，使用50 mL 離心管離心收集菌體，無菌水洗一遍，重懸于20 mL 酵母一步轉化液 （2 mL、2 mol/L LiAc，2 mL、1 mol/L 二硫蘇糖醇，16 mL 50% PEG）中，振蕩混勻，于96 孔板每孔加入100 μL 菌液和1 μL 重組質粒（0.1 ng/μL），45℃孵育30 min。每孔取兩次10 μL 菌液點在SD-Ura固體培養基上，30 ℃培養3 d。

1.2.6 篩選導致產孢缺陷的人類基因挑取轉化得到的表達了人類cDNA 的釀酒酵母單菌落，重懸于10 μL 無菌水，點在SD-Ura 固體培養基上，置于30 ℃恒溫培養箱中培養16 h。將已滅菌的中速定性濾紙貼合在新的SD-Ura 固體培養基上， 影印之前點板培養得到的菌落，使得表達了人類基因的酵母影印到濾紙上，置于30 ℃恒溫培養箱中培養12 h。將濾紙以及濾紙上的釀酒酵母菌落一并轉移到產孢固體培養基上， 置于30 ℃恒溫培養箱中培養24 h。分析方法同1.2.4，通過與表達了空質粒pRS426-TEFpr 的野生型釀酒酵母AN120 對比熒光強度，篩選出在釀酒酵母中表達導致熒光強度明顯降低的候選人類基因，篩選過程見圖1。

1.2.7 復篩得到的候選基因將篩選到的人類基因重新轉化釀酒酵母AN120，轉化過程同1.2.5。 為了檢測初篩得到的候選人類基因在釀酒酵母中表達是否會影響營養細胞的生長，挑取轉化得到的表達了人類基因的釀酒酵母單菌落在SD-Ura 固體平板劃線培養， 將表達了空質粒pRS426-TEFpr 的野生型釀酒酵母AN120 作為對照，30 ℃恒溫培養箱中培養36 h 后進行對比。同時為了檢測在釀酒酵母表達候選人類基因是否穩定抑制產孢過程，將轉化得到的單菌落接入5 mL SD-Ura 液體培養基中，30 ℃、220 r/min 培養16 h， 將100 μL 菌液轉接到5 mL YPACe 培養基種，30 ℃、220 r/min 培養20 h， 離心收集菌體，用無菌水洗滌兩次，測量OD660并以此調整接入產孢液體培養基中的菌液濃度約為3×107個/mL，30 ℃、220 r/min 培養24 h 進行產孢過程。取10 μL 菌液點在血球計數板上， 光學顯微鏡下觀察統計釀酒酵母營養細胞和孢子球的數量，分別統計三次取平均值計算產孢率。

圖1 抑制釀酒酵母產孢的人類基因篩選過程Fig. 1 Screening of human genes specifically inhibits sporulation

1.2.8 DPAI 染色釀酒酵母表達了候選基因導致的產孢過程缺陷，可能是因為減數分裂過程受到抑制或發生了孢子壁形成缺陷。 為了判斷產孢過程缺陷的釀酒酵母是否進入減數分裂過程，將篩選得到的候選人類基因轉入釀酒酵母中進行產孢培養，產孢方法同1.2.7。離心收集孢子，用無菌水洗滌2 次，重懸于70%乙醇，30 ℃、30 min 對孢子進行固定。用無菌水洗滌兩次， 重懸在500 μL 無菌水中并加入0.5 μL、1 mg/mL DAPI 母液，室溫下避光放置20 min進行染色。 用無菌水洗滌兩次，重懸于適量無菌水中， 使用熒光顯微鏡觀察DAPI 染色結果并統計進入減數分裂過程的釀酒酵母比例。

2 結果與討論

2.1 篩選方法的確立

2.1.1 酵母表達質粒的構建作者所在實驗室前期購買的人類cDNA 文庫的克隆載體無法在酵母中表達， 因此作者在實驗室保藏的酵母表達質粒pRS426-TEFpr 中加入attR1/2 位點和ccdB 篩選標記，構建得到pRS426-TEFpr destination vector，利用cDNA 文庫中原質粒載體pENTR221 中含有的attL1/2 交換位點， 通過LR 重組反應， 將原質粒載體pENTR221 中的人類基因重組至酵母表達質粒pRS426-TEFpr 中。轉化DH5α 大腸桿菌菌株，涂布在LB-Amp 固體培養基上， 通過Amp 抗性篩選去除原pENTR221 質粒載體， 通過ccdB 基因篩選去除未能完成重組的pRS426-TEFpr destination vector，最后通過酶切驗證，得到可以在釀酒酵母內表達人類基因的質粒載體pRS426-TEFpr-geneX，并用于之后的篩選。

2.1.2 釀酒酵母產孢率與熒光強度的關系為了驗證釀酒酵母產孢率與二酪氨酸層熒光強度之間的關系，將相同濃度的雙倍體釀酒酵母AN120 和單倍體釀酒酵母AN117-4B 菌液按照2∶8，5∶5，8∶2 的比例混合并點板，隨后進行產孢培養，以得到不同的產孢率， 同時單獨使用釀酒酵母菌株AN120、AN117-4B、dit1Δ 作為對照， 產孢培養結束后測定熒光強度并且統計產孢率。 如圖2 所示，雙倍體釀酒酵母AN120 有著最高的產孢率和熒光強度，無法產孢的單倍體釀酒酵母AN117-4B 與二酪氨酸缺陷型釀酒酵母dit1Δ 有著最低的熒光強度， 混合菌液點板得到的不同產孢率的釀酒酵母熒光強度隨著產孢率的提高熒光強度也隨之增強。

實驗結果證明，釀酒酵母在產孢培養后熒光強度的強弱可以作為判斷釀酒酵母產孢過程中是否發生缺陷的判斷標準。 作者分析產孢培養后釀酒酵母的熒光強度，通過與野生型釀酒酵母孢子的熒光強度進行對比，篩選導致產孢過程發生缺陷的人類基因作為候選基因，該基因有極大可能抑制釀酒酵母的減數分裂過程或導致孢子壁缺陷。

圖2 釀酒酵母產孢率與熒光強度關系Fig. 2 Relate of sporulation rate and fluorescence intensity

2.2 篩選抑制產孢過程的人類基因

本研究將含有人類基因的酵母表達質粒pRS426-TEFpr-geneX 轉入釀酒酵母中， 挑選表達了人類基因的單個轉化子重懸在無菌水中，在SDUra 固體平板上點板培養， 以轉入pRS426-TEFpr空質粒的釀酒酵母AN120、AN117-4B、dit1Δ 作為對照。 用帶有濾紙的新的SD-Ura 固體平板進行影印，等濾紙上長出菌落后將濾紙轉到產孢培養基上培養，取出帶有菌落的濾紙，浸潤在10%氨水緩沖液中，使用凝膠成像儀拍攝UV 照射下的熒光照片。

使用Image J 軟件分析熒光強度， 篩選出熒光強度顯著低于AN120 野生型菌株的轉化子，將其表達的人類基因作為篩選得到的候選基因。 如圖3 所示， 表達了CXCL10，CDC14A，ACP6 這3 個基因的釀酒酵母熒光強度明顯低于野生型釀酒酵母AN120。 如圖4（a）所示，同時挑取表達了這3 個基因的菌落用無菌水重懸，顯微鏡下統計產孢率。 如圖4（b）所示，統計得到的產孢率高低順序與熒光強弱順序結果一致， 其中表達了ACP6 基因的釀酒酵母同時具有最低的熒光強度和產孢率，因此這3 個基因可以作為候選基因。

圖3 UV 照射下的熒光篩選照片Fig. 3 Fluorescence intensity detect by UV

圖4 釀酒酵母表達候選基因后的相對熒光強度與產孢率Fig. 4 Relative fluorescence intensity and sporulation rate of the candidate gene expressed yeast

2.3 驗證候選基因并初步分析

2.3.1 表達候選基因對釀酒酵母營養生長的影響研究希望篩選得到的候選基因在釀酒酵母中表達只會特異性的抑制釀酒酵母的產孢過程，對釀酒酵母的營養生長不會造成抑制，為此將帶有候選基因的質粒的重新轉化釀酒酵母，挑取轉化子在SD-Ura固體平板上劃線培養36 h。 如圖5 所示，表達了候選基因CXCL10，ACP6 的釀酒酵母與野生型生長狀況相同，對釀酒酵母細胞的生長沒有抑制作用。 表達了候選基因CDC14A 的釀酒酵母生長情況相對于野生型受到較弱的抑制， 可能是因為CDC14A（cell division cycle gene14 homolog A） 作為細胞分裂周期蛋白質基因，在釀酒酵母中表達影響了出芽生殖，從而抑制了釀酒酵母細胞的生長。

圖5 表達候選基因對釀酒酵母細胞生長的影響Fig. 5 Express the candidate gene in yeast cells and detect the effect on yeast growth

2.3.2 檢測釀酒酵母產孢率為了確認篩選得到的候選基因對釀酒酵母的產孢過程具有抑制作用，挑選表達了候選基因的轉化子并使用液體培養基進行產孢，產孢結束后吸取菌液，顯微鏡下統計產孢率。 如圖6 所示，表達得到的三個候選基因對釀酒酵母產孢過程具有抑制作用，產孢率由高到低分別是表達了CXCL10、CDC14A、ACP6 的釀酒酵母菌株，與之前篩選結果一致，同時也證明該方法篩選得到的結果較為可靠。

2.3.3 DAPI 染色對減數分裂進行檢測二倍體釀酒酵母在缺乏氮源且存在非發酵型碳源的條件下，營養細胞會停止生長并進入產孢過程，通過減數分裂產生孢子。 為了研究表達了候選基因導致產孢缺陷的釀酒酵母在產孢過程中是否進入減數分裂過程，我們將表達了候選基因的釀酒酵母進行產孢培養后使用核酸染料DAPI 染色， 統計進入減數分裂過程的釀酒酵母比率，并與產孢率進行對比。如圖6所示，表達了CXCL10、CDC14A 基因的釀酒酵母進入減數分裂的比率與產孢率大致相同， 說明表達CXCL10、CDC14A 基因可能導致釀酒酵母無法進入減數分裂過程。 CXCL10（CXC chemokine ligand 10）干擾素誘導蛋白質10 作為趨化因子配體定位于細胞膜上，其在釀酒酵母中表達會抑制產孢過程的原因尚無合理解釋。 表達了ACP6（Lysophosphatidic acid phosphatase type6）溶血磷脂酸磷酸酶基因的釀酒酵母進入減數分裂比率明顯高于產孢率，證明減數分裂過程已經開始， 之前的研究結果證明，ACP6定位于線粒體上，通過調節線粒體脂類代謝功能從而影響線粒體的功能，表達該基因可能導致減數分裂過程中受到抑制或孢子壁形成過程發生缺陷。

圖6 釀酒酵母表達候選基因后的產孢率及產孢過程中進入減數分裂的比例Fig. 6 Sporulation rate and meiosis rate of yeast expressed candidate gene

3 結 語

酵母與同為真核生物的哺乳動物細胞細胞具有很多相似的結構同時具有大量的同源基因，酵母產孢過程中發生的營養敏感性、減數分裂、囊泡重組等細胞活動同樣會發生在哺乳動物細胞中。 將酵母作為人類基因的篩選工具，以及研究同源基因功能的模式生物具有巨大的研究價值。 本研究建立的篩選方法利用釀酒酵母對人類cDNA 文庫進行篩選，獲得在不影響釀酒酵母營養細胞生長的同時特異性抑制酵母產孢過程的人類基因，并通過實驗證明了篩選方法的可靠性。 本研究初次篩選的49 個人類基因中發現了3 個對產孢過程造成抑制的人類基因，并且抑制發生在不同的產孢階段，據此推測應該有相當數量的人類基因會對產孢過程造成影響，因此篩選特異性抑制產孢過程的人類基因具有廣闊的研究前景。 本研究對人類新功能基因的發現以及將釀酒酵母作為模式生物研究人類基因提供了新的方法和思路，同時為之后的篩選與研究奠定了基礎。