不同雜交瘤細胞株單鏈抗體的構建及性質比較

胡 莉， 劉愛平， 王小紅

（1. 黃淮學院 生物與食品工程學院，河南 駐馬店463000；2. 四川農業大學 食品學院，四川 雅安625014；3. 華中農業大學 食品科技學院，湖北 武漢430070）

黃曲霉毒素B1（AFB1）主要是由產毒黃曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉產生的具有極高毒性的次生代謝產物。 AFB1 可以在農作物生長、收獲、貯藏、運輸和銷售等任何環節中產生，并由此直接進入食物鏈，造成淀粉類食品、動物性食品與肉、蛋、奶等的交叉污染。 AFB1 對人和動物的肝臟具有很強的毒性，是國際公認的致癌物質[1]。 因此，AFB1 的檢測與分析技術的研究是非常必要的。 到目前為止，關于AFB1 分析檢測方法的研究報道很多， 如薄層層析法、高效液相色譜法、納米金標記法、免疫親和柱法和近紅外光譜法[2-5]。 免疫化學學分析法因具有快速、簡單、靈敏、針對性強等優點而被廣泛應用，在這些檢測方法中，其中ELISA 法要求有較高質量的抗體[6-13]。

在過去的十年里，在抗黃曲霉毒素多克隆抗體的基礎上，對半抗原具有不同親和力的抗黃曲霉毒素單克隆抗體應運而生。 在免疫檢測方法中，抗原和抗體之間的高親和力是非常重要的。 隨著抗體技術的發展，重組抗體尤其是單鏈抗體（ScFv）已經運用到黃曲霉毒素的檢測中[14]。重組抗體具有成本低、易于操作的親和力和靈敏度的特點。 而且，通過定點突變的方法可以提高抗體親和力。

單鏈抗體（single chain Fv antibody fragmment，ScFv）是由抗體的重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL） 通過一段約45~75 個堿基組成的柔性肽（Linker）連接而得到的[15-17]，是一種新型重組小分子抗體蛋白質。 scFv 僅為完整抗體的1/6 大小，由于其相對分子質量小，結構單位小，因此其組織穿透力強，免疫原低，可在多種表達系統中表達，具有成本低，血流中半衰期短等特點，在醫學和生物學領域中的應用極為廣泛[18-21]。又由于scFv 易于制備、無Fc 段引起的非特異性反應、易于改造且表達產量高而獲得了研究學者們的廣泛關注。 scFv 中的VH 和VL 來源于不同的雜交瘤細胞， 構建成的scFv 的靈敏度、特異性等生物活性也有所不同。

作者所在實驗室通過大量篩選，最后得到幾株能穩定分泌抗黃曲霉毒素單克隆抗體的三株雜交瘤細胞株（2C10、2E6 和2H1），在這些細胞中，2C10雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體表現有最高的靈敏度，2E6 次之，2H1 再次之。 分別提取雜交瘤細胞的總RNA，設計通用引物，采用分子生物學技術分別克隆其相應的重鏈可變區 （heavy chain variable region，VH） 和 輕 鏈 可 變 區 （light chain variable region，VL）基因，以一段連接肽（Linker）將VH 和VL 連接起來，組裝成三種不同的scFv 基因。將通過融合PCR 構建的scFvs 在大腸桿菌表達系統中進行蛋白質表達，純化蛋白質后通過競爭ELISA 法展現不同的單克隆抗體與所對應的單鏈抗體靈敏度之間的關系；另外分別對編碼單鏈抗體的3 種可變區基因（VH/VL）進行克隆和測序，并對此做核酸同源性分析和氨基酸同源性分析。 通過可變區基因序列的比對， 比較VH 和VL 來源的不同對scFv 生物活性的影響，初步探究具有高靈敏度蛋白質的堿基結構組成， 以便后續改善和提高重組抗體的靈敏度，并獲得更高靈敏度的重組抗體。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

AFB1： 購于瑞士Alexis 公司； 雜交瘤細胞株2C10、2E6、2H1 和E.coli菌株Trans5α、表達菌株E.coliBL21（DE3）及表達載體pET-30a：為作者所在實驗室常規保存；Easy Taq 酶、 Trans2K Plus DNA Marker、Trans5K Plus DNA Marker：購于中國北京全式金生物技術有限公司； 限制性內切酶、DNA 連接酶、PMD19-T Simple Vector： 購自TaKaRa 公司；質粒小提、DNA 凝膠回收試劑盒： 購自杭州AxyGen；引物：南京金斯瑞生物科技有限公司合成；羊抗小鼠IgG-HRP 酶標二抗： 購于中國華美生物工程公司；質粒提取試劑盒：購于中國北京擎科新業生物技術有限公司；Ni-NTA 親和層析填料、ECL 顯色液、Page RulerPrestained Protein Ladder： 購于美國Thermo 公司；DNA 凝膠回收純化試劑盒：購于中國北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計與目的基因擴增活化并亞克隆實驗室篩選保存的靈敏度分別為 9.54、85.76、203.00 ng/mL[22]的 三 株 雜 交 瘤 細 胞 株2C10、2E6 和2H1， 收集8×106雜交瘤細胞， 采用TRIzol 試劑（Invitrogen，USA） 分 別 進 行 總RNA 的 提 取。 以oligo-dT18 為引物，經反轉錄PCR（RT-PCR）獲得三種不同的單鏈cDNA。 RT-PCR 反應體系為25 μL：5 μL 的5×primescript buffer，1 μL 的50 mmol/L oligo-dT18，2 μL 的2.5 mmol/L dNTP 溶液，0.5 μL的RNase inhibitor，5 μL 的總RNA，以及0.5 μL 的primescript RTase（200 U/μL），11 μL 的DEPC 處理過的ddH2O。RT-PCR 反應程序為：25 ℃10 min，42℃1 h，70 ℃15 min。

分別以已經獲得的cDNA 為模板， 以VHFOR、VH-Back、VL-FOR 和VL-Back 為引物[23-24]，PCR 擴增VH 和VL 基因，見表1。 將獲得的VH 和VL 基因片段分別連接到載體pMD19-T 上，將獲得的重組載體pMD19-T-VH 和pMD19-T-VL 轉化到E. coliTrans5a 細胞中，以便基因測序。

以已經測序成功的重組質粒pMD19-T-VH-2C10/2E6/2H1 和pMD19-T-VL-2C10/2E6/2H1 分別為模板， 設計相應的引物， 采用重疊延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）擴增scFv-2C10/2E6/2H1 基因片段[25]，并在目的基因兩端分別引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點。

首先，以引物1 和引物2 為引物，PCR 擴增出3種帶有部分Linker 的VH-Linker 片段；以引物3 和引物4 為引物，PCR 擴增出3 種帶有部分Linker 的Linker-VL 片段。 PCR 擴增條件如下：95 ℃預變性5 min，（94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），28 個循環，72 ℃延伸8 min。每輪PCR 后，將3 μL PCR 產物與1 μL 6 × Loading buffer 混勻，采用0.8 g/dL 的瓊脂糖凝膠電泳分析并借助凝膠回收試劑盒分別純化回收不同的PCR 產物VHLinker 和Linker-VL。 然后， 通過SOE-PCR 構建scFv-2C10/2E6/2H1 基因。 SOE-PCR 分兩步：第一步， 以上述回收的產物VH-Linker 和Linker-VL 為模板進行PCR 擴增反應，將VH 和VL 通過Linker連接合成一條單鏈。 PCR 擴增條件如下：95 ℃預變性5 min；（94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），10 個循環；72 ℃延伸8 min。經0.8 g/dL 的瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收PCR 產物。 第二步， 以第一步純化產物為模板， 以引物1 和引物4為引物， 分別PCR 擴增scFv-2C10/2E6/2H1 基因。PCR 擴增條件如下：95 ℃預變性5 min；（94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min），30 個循環；72 ℃延伸10 min。 經0.8 g/dL 的瓊脂糖凝膠電泳分析并分別純化回收PCR 產物。 根據基因來源的不同， 最后獲得3 種不同的PCR 產物， 即為NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2C10、NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2E6 和NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2H1。

表1 VH、VL 和scFv 基因PCR 擴增、克隆所用的引物序列Table 1 Nucleotide sequences and primers used for VH,VL and scFv amplification, cloning, and subcloning

1.2.2 重組質粒pET-30a-pelB-scFv-2C10/2E6/2H1 的構建和鑒定PelB 信號肽可以引導蛋白質產物在細胞周質表達，為了方便后續的蛋白質純化工作， 現將pET-22b 載體上的pelB 信號肽序列克隆到最終使用載體pET-30a 上，方法分為兩步。 首先將 “1.2.1” 中第二步獲得的PCR 產物NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2C10、NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2E6、NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2H1 和質粒pET-22b 均采用限制性內切核酸酶NcoⅠ和XhoⅠ進行雙酶切， 純化回收產物后，采用DNA 連接酶將scFv-2C10/2E6/2H1 和pET-22b 進行連接獲得重組質粒pET-22b-scFv-2C10/2E6/2H1，并轉化E. coliTrans5α 細胞。挑取單克隆進行菌落PCR 驗證。

然后提取上述陽性克隆子pET-22b-scFv-2C10/2E6/2H1 的質粒， 純化后將重組質粒pET-22b-scFv-2C10/2E6/2H1 和質粒pET-30a 分別用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，純化回收產物后，采用DNA 連接酶將pelB-scFv-2C10 和pET-30a 進行連接， 獲得重組質粒pET-30a-pelB-scFv-2C10/2E6/2H1 并轉化E. coliTrans5α 細胞。 挑取單克隆進行菌落PCR 驗證，選取陽性轉化子送至南京金思瑞生物科技有限公司測序。

測序正確的陽性轉化子培養并提取質粒后，將空載體pET-30a 和所提取質粒分別轉化到BL21（DE3）感受態細胞中，挑取菌落轉化子進行PCR 驗證， 陽性轉化子分別命名為BL21 （DE3）-pET-30a和BL21（DE3）-pET-30a-pelB-scFv-2C10/2E6/2H1。

1.2.3 重組質粒pET-30a-pelB-scFv 的表達及鑒定無菌條件下挑取1.2.2 中轉化成功的單菌落轉化子BL21 （DE3）-pET-30a 和BL21 （DE3）- pET-30apelB-scFv-2C10/2E6/2H1，分別培養于100 mL 液體LB 培養基中（含有100 μL 的50 mg/mL 的kana），于200 r/min、37 ℃條件下培養至OD600nm為0.8 左右時， 加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），并使其終濃度為1 mmol/L，16 ℃誘導表達20 h。多次試驗發現，誘導時間為20 h 時蛋白質表達量達到最高。 收集菌體，進行蛋白質預表達分析實驗。

由于pelB 信號肽的存在， 所以基本確定目的蛋白質主要存在于細胞周質內。 又由于只有當新生肽鏈的合成速率大于蛋白質折疊速率時，蛋白質才會以包涵體的形式存在，而肽鏈的合成速率又與溫度有著直接的關系， 選擇16 ℃低溫誘導蛋白質的表達可以有效地避免包涵體形式的形成，且實驗證明的確如此。

采用SDS-PAGE 對scFv-2C10/2E6/2H1 的預表達情況進行驗證分析， 將破碎后的菌體細胞于4℃低溫離心， 可溶性蛋白質經鎳柱親和層析法進行蛋白質純化，純化后的蛋白質與上樣緩沖液混勻后煮沸6 min 直接上樣，經SDS-PAGE 驗證后，接著轉印PVDF 膜，再以5%牛奶封阻PVDF 膜，最后采用羊抗小鼠IgG-HRP 酶標二抗孵育后， 利用ECL顯色液顯色，觀察結果。

1.2.4 抗AFB1 scFvs-2C10/2E6/2H1 的性質分析以20 mL PBS 緩沖溶液懸浮，在冰浴條件下將細胞超聲破碎（30 min，功率105 W，2 s 開啟，2 s 關閉），4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用鎳柱親和層析純化上清液，純化后所得到的蛋白質經SDS-PAGE 初步驗證后，再以間接競爭ELISA 檢測上述兩種表達載體所表達的目的蛋白質抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 的靈敏度， 試驗中以pET-30a空載體的表達為陰性對照。

用CBS 緩沖液稀釋AFB1O-OVA 為1 μg/mL，包被96 孔板過夜，PBST 洗滌甩干。 每孔加入200 μL 封阻液，37 ℃靜置2 h， 甩干封阻液，PBST 洗滌甩干。 每孔加入90 μL 用PBST 稀釋的抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 和10 μL 以PBS 稀釋的不同質量濃度的AFB1 溶液（質量濃度分別為2、8、20、40、60 μg/mL），37 ℃靜置1 h， 甩干液體，PBST 洗滌甩干。 每孔加入100 μL 的羊抗鼠IgG-HRP 酶標二抗（以PBST 4 000 倍稀釋），37 ℃靜置1 h，甩干液體，PBST 洗滌甩干。 每孔加底物緩沖液100 μL，37 ℃靜置15 min， 每孔加入50 μL、2 mol/L H2SO4終止反應，492 nm 測吸光值。

2 結果與分析

2.1 目的基因scFv-2C10/2E6/2H1 擴增

以 質 粒 pMD19 -T -VH -2C10/2E6/2H1 和pMD19-T-VL-2C10/2E6/2H1 分別為模板，經SOEPCR 第一步擴增產物為模板， 進行第二步PCR，獲得兩端帶有酶切位點的產物scFv-2C10/2E6/2H1 基因。 經0.8 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳檢測， 大小約為750 bp， 與理論值一致， 見圖1。 回收試劑盒回收scFv-2C10/2E6/2H1 基因片段。

2.2 株間氨基酸序列同源性比較

由于三種VH 氨基酸和VL 氨基酸均來自于雜交瘤細胞， 且單克隆抗體的靈敏度高低順序為2C10＞2E6＞2H1， 因此使用NCBI Blast 分析比對各株間VH、VL 氨基酸序列的同源性， 比對分析結果分別見表2～3。

圖1 scFv-2C10/2E6/2H1 基因的PCR 擴增結果Fig. 1 PCR results of amplification scFv-2C10/2E6/2H1

表2 不同VH 氨基酸序列比較分析Table 2 Homology analysis of different VH amino acid sequence

表3 不同VL 氨基酸序列比較分析Table 3 Homology analysis of different VL amino acid sequence

由表2~3 可知， 菌株2C10 和2E6 之間的重鏈可變區氨基酸序列的同源性是100%， 與2H1 的同源性只有42.74%；2H1 和2C10、2E6 和2C10 之間的輕鏈可變區氨基酸序列的同源性分別為42%和43%， 而2E6 和2H1 之間的同源性可以達到59%。相同的重鏈，不同的輕鏈對單鏈抗體的生物活性也有一定的影響。

2.3 重組質粒pET-30a-pelB-scFv 的構建及鑒定將pET-30a 質粒和回收產物pelB-scFv-2C10/

2E6/2H1 分別進行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切反應和連接反應，獲得重組質粒pET-30a-pelB-scFv。 將重組質粒轉化到E.coliTrans5α 細胞，挑取轉化子，以引物1 和引物4 對其進行菌落PCR 驗證，見圖2（a）。PCR 產物大小約為750 bp，與理論預期值一致。 測序結果進一步驗證了重組質粒構的建成功。

將測序成功的陽性轉化子pET-30a-pelB-scFv和空質粒pET-30a 分別轉化到BL21（DE3）感受態細胞中，轉化子進行PCR 驗證，見圖2（b），PCR 產物大小約為750 bp，與理論值一致。

圖2 含目的基因的轉化子PCR 驗證結果Fig. 2 PCR results of transformants containing target gene

2.4 重組質粒pET-30a-pelB-scFv 的表達及鑒定

挑取固體LB 平板上生長的陽性菌落進行誘導表達， 鎳柱親和法純化表達蛋白質， 采用SDSPAGE 和Western blot 對 抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 蛋白質進行驗證， 結果見圖3。 由圖3 可知，SDS-PAGE 和Western blot 鑒定結果表明已成功誘導表達了目的蛋白質，該蛋白質相對分子質量約為29 000，與目的蛋白質理論值一致。 BCA 法測定誘導20 h 純化后目的蛋白質的產率約為34 mg/L。

2.5 抗AFB1scFv-2C10/2E6/2H1 的性質分析

分別以間接非競爭ELISA 和間接競爭ELISA純化后的scFv-2C10/2E6/2H1 進行分析。 間接非競爭ELISA 表明，AFB1O-OVA 包被質量濃度為1 μg/mL，抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 的質量濃度約為0.17 mg/mL 時，OD492nm約為1.0。 在此條件下，以AFB1 為競爭抗原， 進行間接競爭ELISA 檢測不同表達系統表達的目的蛋白質的靈敏度，并取五點以繪制scFv-2C10/2E6/2H1 的間接競爭抑制曲線，由圖4 可知， 目的蛋白質scFv-2C10/2E6/2H1 的檢測靈敏度分別約為40、50 μg/mL 和大于50 μg/mL。可以看出，隨著單克隆抗體靈敏度的下降，它所對應的單鏈抗體的靈敏度也隨之降低。這表明scFv 的靈敏度與其本身的VH 和VL 的基因組成相關， 要想改變scFv 的靈敏度，可以考慮改變其基因組成。

圖3 抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 表達的SDS-PAGE 和Western-blot 分析Fig. 3 SDS -PAGE and Western -blot analysis for expression of anti-AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1

圖4 scFv-2C10/2E6/2H1 的間接競爭ELISA 抑制曲線Fig. 4 IC-ELISA inhibition curves of pET-30a-pelBscFv-2C10/2E6/2H1

3 結 語

基于AFB1 的毒性，其檢測極限顯得尤為重要。目前的檢測分析方法中使用較廣的是酶聯免疫吸附法，該法以檢測快速、靈敏、樣品制備簡單等優點而廣受關注。 在該檢測方法中，抗體是核心試劑，以實驗室保存的抗AFB1 單克隆雜交瘤細胞株為原料構建不同的scFv 基因。

目前，對于外源蛋白質的表達，E. coli表達系統是應用較多、 研究較多的， 也最具有代表性的，E.coli作為AFB1scFv 的表達系統，E. coli具有操作方便快速、實驗周期不長、生產成本小等優點。

pelB 信號肽可以引導目的蛋白質在細胞周質內表達，并且采取一定的手段可以避免包涵體的形成，增加可溶蛋白質的表達，提高純化效率[26]。 基于此，實驗先將目的基因克隆到帶有pelB 信號肽的載體pET-22b 上， 再將pET-22b 上的pelB 信號肽序列和目的基因序列一同克隆到載體pET-30a 上，這樣是為了充分利用pelB 信號肽的上述特性。 基于此，實驗將三種目的基因分別轉化E. coli表達體系進行蛋白質表達。 最終本研究成功構建了三種重組載體pET-30a-pelB-scFv-2C10/2E6/2H1，并將其轉化到相應的表達細胞中進行蛋白質表達， 以分析scFv 的親和力是否與其對應的單克隆抗體有關。 實驗結果顯示， 蛋白質最高表達量約為34 mg/L。 經ELISA 實驗結果表明， 三種目的蛋白質scFv-2C10/2E6/2H1 均顯示出活性， 檢測靈敏度分別約為40、50 μg/mL 和大于50 μg/mL。 這說明隨著單克隆抗體靈敏度的升高，其所對應的單鏈抗體的靈敏度也隨之升高，原因可能是scFv 的靈敏度與其堿基組成息息相關。其次，由于2C10 和2E6 的重鏈可變區的堿基組成是相同的，而二者的靈敏度卻有一定的差距，這充分說明單鏈抗體與抗原的結合位點不僅存在于重鏈，輕鏈的影響也很大。 所以，接下來的實驗要想調高其靈敏度， 還需要大量的實驗分析和改進，分析其原因最終可能是因為scFv 的自身編碼基因的親和力不夠高，所以在未來的實驗中，可能會采取基因工程技術手段，如基因定點突變或隨機突變等對scFv 的親和力進行提高。