羅伊氏乳桿菌產羅伊氏細菌素的工藝優化

萬心怡， 徐學明， 吳鳳鳳

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

羅伊氏乳桿菌 （Lactobacillus reutrei） 是美國FDA 認證的一種安全和健康的食品補充劑，廣泛地存在于人、豬、家禽和其他動物的胃腸道中[1]。 在甘油溶液中，羅伊氏乳桿菌能轉化甘油生產的羅伊氏細菌素（Reuterin）。 羅伊氏細菌素是一種由3-羥基丙醛的單體、水合物和環狀二聚物混合組成的天然廣譜抑菌物質，在水溶液中存在動態平衡[2]。 羅伊氏細菌素能有效抑制革蘭氏陰性菌、陽性菌、酵母菌、霉菌和原生動物的生長[3]，可作為抑菌劑[4-7]、抗感染治療劑[8-10]、生物交聯劑[11]、新型生物材料[12]等。 目前已知能轉化甘油生成羅伊氏細菌素的微生物主要是桿菌屬（Bacillus），克雷伯菌屬（Klebsiella），檸檬菌屬（Citrobacter），腸桿菌屬（Enterobacter），梭菌屬（Clostridium）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）[13-17]。其中Klebsiella pneumonia和L. reuteri具有較高轉化甘油生產羅伊氏細菌素的能力， 是研究較多的菌株。有研究指出： 在純的甘油溶液中，L. reuteri是已知微生物中產羅伊氏細菌素最強的菌株[3]。

目前利用L.reuteri生產羅伊氏細菌素的產量普遍小于150 mmol/L[8，18-20]。 Lüthi-Peng 等人在厭氧的條件下， 利用L.reuteri細胞轉化200 mmol/L 甘油生成170 mmol/L 的羅伊氏細菌素[21]，這是已有報道中較高的產量，但仍然達不到工業生產的要求。 由于羅伊氏細菌素對細胞有毒害作用， 限制了體外高濃度的積累。 許多研究者在轉化過程中添加氨基脲[22-23]、亞硫酸氫鈉[24-25]，能有效降低這種影響，使羅伊氏細菌素在體外較高濃度積累，但這些方法也增加了產物分離純化的難度。 本研究旨在優化L.reuteri生產羅伊氏細菌素的條件，提高羅伊氏細菌素的生產效率和產量，為今后大規模的工業化生產提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

輔酶CoB12和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物（MBTH）：購于Sigma 公司；蛋白胨和酵母粉：購于Oxoid 公司；其他試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

Shimadzu 高效液相色譜儀（LC-20AT）；DWS 厭氧培養箱； 北京普析紫外/可見分光光度計 （TU-1900）； 上海之信細胞破碎儀 （JYD-990L）；Thermo高速離心機。

1.2 靜息細胞的制備

細胞的制備方法參照Axelsson 等人[4]并有稍許修 改。 羅 伊 氏 乳 桿 菌 （Lactobacillus reuteri）ATCC53608 在MRS 培養基 （蛋白胨1%， 牛肉膏1%，酵母粉0.4%，葡萄糖2%，硫酸鎂0.02%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸三胺0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸錳0.005%，吐溫80 0.1%）中37 ℃靜置過夜培養活化。 活化兩次后的種子液以6%的接種體積分數接種到MRS 培養基中， 厭氧條件下靜置發酵培養24 h。發酵后的菌懸液經5 000 r/min 離心10 min，并用磷酸緩沖液（pH 7.0）沖洗一次，以收集濕細胞。

1.3 羅伊氏細菌素的制備

將收集的濕細胞加入到7 mL 已滅菌的甘油溶液（100~500 mmol/L）中，在不同的設定溫度（20~50 ℃）中厭氧靜置培養（0.5~5 h）。 菌懸液經10 000 r/min離心5 min，獲得的上清液在4 ℃下保存。

1.4 羅伊氏細菌素的檢測

羅伊氏細菌素的檢測方法參照Circle 等人[26]的方法。 由于羅伊氏細菌素沒有標品，而羅伊氏細菌素在酸性條件下能脫水生成丙烯醛，丙烯醛在濃鹽酸的作用下可與色氨酸進行縮合反應，生成紫色化合物，其最大吸收峰在560 nm 處。 因此可以用比色的方法來檢測羅伊氏細菌素的含量， 并且1 mol 的羅伊氏細菌素反應后生產1 mol 的丙烯醛， 故用丙烯醛標準品配置成0~0.7 mmol/L 的溶液，繪制標準曲線。 樣品檢測時，在10 mL 的離心管中加入1 mL的樣品、0.75 mL 的色氨酸試劑、3 mL 的濃鹽酸混勻，37 ℃下保溫20 min 后檢測在OD560的吸光值。

1.5 甘油脫水酶酶活的檢測

細胞懸浮液置于冰浴中超聲細胞破碎 （功率300 W，破壁1 s，間歇3 s，重復300 次）。 破碎后于4 ℃條件下10 000 r/min 離心5 min，上清液即為粗酶液。 甘油脫水酶活力的檢測方法參照Toraya 等人[27]的3-甲基-2-苯并咪唑腙法。 甘油在甘油脫水酶的作用下生成3-羥基丙醛， 生成的3-羥基丙醛與3-甲基-2-苯并咪唑腙（MBTH）反應生成腙類化合物，因此可以用比色的方法來檢測。 在5 mL 的離心管中加入100 μL 的2 mol/L 1，2-丙二醇，100 μL 的0.5 mol/L KCl，10 μL 的1.5 mmol/L 輔 酶B12，690 μL 的50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.0），100 μL 的粗酶液，37 ℃保溫10 min。 加入1 mL 的0.1 mol/L檸檬酸鉀緩沖液（pH 3.6）終止反應，再加入0.5 mL的新配0.1%MBTH，37 ℃保溫15 min。 最后加入1 mL 的蒸餾水，混合均勻后在305 nm 處測吸光值。 1個酶活單位定義為： 在37 ℃、pH 7.0 條件下，1 min催化生成1 μmol 丙醛所需的酶量。

粗酶液蛋白質含量測定方法參照Bradford 法[28]，以牛血清蛋白為標品。

1.6 甘油濃度的檢測

甘油濃度通過高效液相色譜檢測， 色譜條件為：ZORBAX NH2柱，柱溫30 ℃，流動相乙腈∶水=9∶1（V/V），流速1 mL/min，示差折光檢測器。 樣品檢測前用0.45 μm 微孔濾膜過濾。

2 結果與討論

2.1 菌齡對羅伊氏細菌素產量的影響

處于不同菌齡的細胞，它的生理狀態有一定的差異，這會顯著影響L. reuteri細胞內甘油脫水酶的酶活。如圖1 所示，在厭氧發酵的早期階段，L.reuteri細胞內甘油脫水酶的酶活非常低，14 h 后酶活顯著增加。當細胞處于穩定期初期（26 h），細胞內甘油脫水酶的酶活達到最大2.2 U/mg，之后穩定在2 U/mg左右。 因此，使用穩定期初期的細胞用于酶轉化，有利于提高羅伊氏細菌素的產量，這與Stevens 等人[24]的研究結果類似。

圖1 菌齡對羅伊氏細菌素產量的影響Fig. 1 Effects of cells age on the reuterin production

2.2 緩沖溶液濃度和pH 對羅伊氏細菌素產量的影響

不同離子濃度會影響微生物的生理活性，因此研究不同緩沖溶液濃度對羅伊氏乳桿菌生產羅伊氏細菌素的影響。 如圖2（a）所示，以不同濃度的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀（PBS）作為甘油溶液的緩沖體系，控制pH 穩定在6.0。 隨著緩沖溶液濃度的增加，羅伊氏細菌素的產量顯著增加。 當緩沖溶液濃度為0.08 mol/L 時，產量達到峰值。當濃度超過0.2 mol/L 后，羅伊氏細菌素濃度急劇下降。 這是因為當緩沖溶液濃度較低時，緩沖穩定性相對較差，甘油溶液pH 不能穩定在最適值； 當緩沖溶液濃度超過0.08 mol/L 后，細胞有一定的自我調節能力，而超過一定濃度后，溶液中離子強度過高，影響細胞的生理活性，細胞轉化能力急劇下降。

pH 值能顯著影響羅伊氏乳桿菌內甘油脫水酶的活性， 不同微生物來源的甘油脫水酶的最適pH差異較大。 肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）和弗勞地枸櫞酸桿菌（C.freundiiDSM 30040）來源的甘油脫水酶，其最適pH 為8.5[29-31]。與其他來源的甘油脫水酶相比，L. reuteri來源的甘油脫水酶的最適pH 偏低。 馬會亮等人研究發現羅伊氏乳桿菌（L. reuteriCG001）中的甘油脫水酶最適pH 在6.2 左右[32]。 因此研究了不同pH 值對L. reuteri生產羅伊氏細菌素的影響， 并比較了用緩沖溶液控制恒定pH 和只調節初始pH 的差異。分別利用磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖體系控制甘油溶液保持不同的恒定pH，以及用HCl、NaOH 把甘油溶液配置成不同的初始pH。分別檢測酶轉化1 h 后羅伊氏細菌素產量。如圖2（b）所示，在兩種不同的pH 調節方式下，當pH 6 時羅伊氏細菌素的產量都表現為最大值。 并且在弱酸的條件下，有利于L.reuteri生產羅伊氏細菌素。

圖2 不同緩沖溶液濃度和pH 對羅伊氏細菌素產量的影響Fig. 2 Effects ofbuffer concentration and pH on the reuterin production

2.3 甘油濃度對羅伊氏細菌素產量的影響

甘油作為催化反應的底物，其濃度對羅伊氏細菌素產量有顯著影響。 作者研究了不同濃度的甘油作為底物，催化1 h 后羅伊氏細菌素的產量，見圖3。甘油濃度低于300 mmol/L 時，羅伊氏細菌素的產量隨著甘油濃度的增加而增加，甘油轉化為羅伊氏細菌素的比例（甘油轉化率）均在50%以上。 之后隨著甘油濃度再增加，產量逐漸降低。 實驗表明，在一定范圍內增加甘油濃度有利于羅伊氏細菌素產量的提高，由于甘油是羅伊氏乳桿菌的自殺底物，過高的甘油濃度會抑制菌體的生長。 因此，靜置培養時，300 mmol/L 的甘油濃度是最適合的底物濃度，同時在實際生產時可以采取流加甘油的形式，使甘油濃度維持在一定范圍，從而降低甘油對菌體的抑制作用。

圖3 甘油濃度對羅伊氏細菌素產量的影響Fig. 3 Effect of glycerol concentration on the reuterin production

2.4 酶轉化時間對羅伊氏細菌素產量的影響

羅伊氏乳桿菌體內存在代謝甘油的還原途徑[3，33]。甘油經依賴輔酶B12的甘油脫水酶轉化為羅伊氏細菌素[30，34]，再經依賴NAD+的1，3-丙二醇脫氫酶轉化為1，3-丙二醇[35-37]。 羅伊氏細菌素是甘油兩步代謝的中間產物，酶轉化時間能影響羅伊氏細菌素和副產物1，3-丙二醇的產量。 如圖4 所示，隨著時間的增加，羅伊氏細菌素的產量顯著增加，在1 h 后達到最大值154 mmol/L，之后隨著反應時間的延長產量逐漸降低。 由于甘油轉化成羅伊氏細菌素的途徑中，需要依賴輔酶B12的甘油脫水酶的催化，并且在催化的同時，輔酶B12的C-Co 鍵由于底物甘油的作用， 發生不可逆的斷裂形成5’-脫氧腺苷和烷基鈷氨素類似物，而甘油脫水酶與形成的烷基鈷氨素結合，致使甘油脫水酶失活[38]。推測隨著發酵時間的延長，胞內的甘油脫水酶由于甘油的自殺抑制作用逐漸失活。 1 h 后大部分的甘油脫水酶失活，這時細胞不再能轉化甘油，而胞內還殘留有NADH，羅伊氏細菌素經依賴NADH 的1，3-丙二醇脫氫酶繼續轉化形成1，3-丙二醇；或是能轉化少量甘油，但產生羅伊氏細菌素的量低于羅伊氏細菌素反應生成1，3-丙二醇的量，這都能使得檢測到的羅伊氏細菌素濃度降低。

2.5 接種量對羅伊氏細菌素產量的影響

甘油脫水酶作為反應的關鍵限速酶，其濃度直接決定催化反應速率。 在酶轉化過程中，反應速率表現為甘油溶液中的細胞濃度。 如圖5 所示，接種量從20 mg/mL 增加到80 mg/mL 時，羅伊氏細菌素產量呈線性增加； 接種量超過100 mg/mL 之后，隨著接種量的增加， 羅伊氏細菌素的產量反而減少。這可能是因為細胞濃度過高，細胞與甘油的接觸比表面積減小，導致傳質阻力增大而酶轉化速率下降。

圖4 發酵時間對羅伊氏細菌素產量的影響Fig. 4 Effect of enzyme conversion time on the reuterin production

圖5 接種量對羅伊氏細菌素產量的影響Fig. 5 Effect of cell concentration on the reuterin production

2.6 溫度對羅伊氏細菌素產量的影響

溫度不僅能影響細胞內甘油脫水酶的酶活，還能影響羅伊氏細菌素對細胞的毒害作用[20]，因此設置不同溫度，觀察溫度對細胞產羅伊氏細菌素的影響。圖6 表明，30 ℃時羅伊氏細菌素的產量最大，同時在較低的溫度下（20 ℃），還能保持較高的羅伊氏細菌的產量， 推測低溫有利于羅伊氏細菌素的積累。 此結果不同于Chen 等人報道的羅伊氏乳桿菌酶轉化的最佳溫度為37 ℃， 以及溫度對酶轉化影響的規律[18]，但與Doleyres 等人研究的溫度對羅伊氏乳桿菌ATCC 53608 的影響結果相似[20]。

圖6 溫度對羅伊氏細菌素產量的影響Fig. 6 Effect of temperature on the reuterin production

2.7 正交實驗優化

在單因素實驗的基礎上，采用L16（45）正交表設計實驗，研究了緩沖溶液pH 值、甘油濃度、酶轉化時間、接種量、溫度對羅伊氏細菌素產量的影響，實驗安排及結果見表1-2。

由表2 可以看出，實驗的5 個因素對羅伊氏細菌素的產量都有極顯著影響（P＜0.01），影響羅伊氏細菌素產量因素的主次排序依次是：B（甘油濃度）＞D（接種量）＞C（時間）＞E（溫度）＞A（pH）。根據多重比較確定各因素的最佳水平組合為B4D4C4E3A4， 其中A3和A4無顯著性差異。 考慮到甘油脫水酶的最適pH 為6.2， 為了節約在實際應用中控制pH 使用的堿液的量，最佳pH 定為6.2。因此，全細胞轉化生產羅伊氏細菌素的最佳條件為：甘油濃度400 mmol/L，接種量110 g/L，酶轉化時間120 min，溫度30 ℃，發酵pH 6.2。

對最佳條件進行驗證試驗，6 次獨立重復實驗，羅伊氏細菌素平均產量達到（241.2±3.4） mmol/L，較單因素實驗中最佳產量提高了30%。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factor level of orthogonal design

表2 方差分析表Table 2 Analysis of variance for the orthogonal design

3 結 語

研究發現，處于穩定期初期的L. reuteri，其細胞內甘油脫水酶的酶活最大，有利于轉化甘油生產羅伊氏細菌素。 通過單因素和正交實驗的優化，L.reuteri轉化甘油生產羅伊氏細菌素的產量達到了（241.2±3.4） mmol/L，生產的效率和產量得到了顯著提高，為今后大規模的工業化生產提供一定的指導。