提高產反式-4-羥脯氨酸工程菌產量的發酵策略

王曉姣， 楊慧敏， 張震宇， 孫付保， 周 豪

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

反式-4-羥脯氨酸 （trans-4-hydroxyproline，P4H）簡稱羥脯氨酸，分子式為C5H9NO3，可以與茚三酮反應生成黃色溶液[1]。 它易溶于水，微溶于乙醇溶液，呈現出獨特的甜味。 同時，P4H 是構成膠原蛋白的一種特征性氨基酸，很少存在于普通的蛋白質中。P4H 可用于食品、美容、醫療、化工等多個領域[2-4]，P4H 的生產得到眾多研究者的關注。

羥脯氨酸是L-脯氨酸通過脯氨酸羥化酶羥化得到的。 研究者通過脯氨酸羥化酶，使得微生物法生產羥脯氨酸成為了一種可能[5]。 但在該生產過程中，L-脯氨酸作為合成羥脯氨酸的底物， 需要外源添加，這使得羥脯氨酸的工業化生產成本增大。 同時，由于發酵液終會殘留L-脯氨酸，增加了羥脯氨酸的分離純化難度。 為了解決這些問題，研究者通過代謝途徑改造、菌株重組等方式實現了無外源添加L-脯氨酸生產羥脯氨酸[6-7]。研究前期成功構建了一株重組大腸桿菌E.coliJM109ΔargB/pUC19-BH，該菌株含有表達谷氨酸激酶的突變基因proB2A，突變后的基因解除了L-脯氨酸的反饋抑制作用；同時，該菌株敲出了精氨酸代謝途徑中的關鍵酶（N-乙酰谷氨酸激酶）基因argB，使得精氨酸合成途徑受阻，是一株精氨酸缺陷型菌株，見圖1。 搖瓶水平下，該菌株在無外源添加L-脯氨酸的情況下，羥脯氨酸的積累量約為920 mg/L。

圖1 大腸桿菌中羥脯氨酸生物合成途徑Fig. 1 Biosynthetic pathways of P4H in E. coli

利用微生物進行生產發酵的過程中，影響微生物生長及代謝產物合成的因素非常多，培養基的組成以及培養條件如培養溫度等均需要考慮[8-10]。研究表明，碳源是微生物必需的能源物質，常見的碳源種類很多，如葡萄糖、麥芽糖、甘油等，不同菌株對于碳源的需求不同。 同時，碳源質量濃度過高或過低，均不利于菌體的生長。 因此，選擇合適的碳源以及恰當的碳源質量濃度是利用微生物進行生產的前提。 微生物發酵過程中另一種必不可少的物質是氮源。 氮源質量濃度過高，菌體生長旺盛；氮源質量濃度過低，菌體生長較慢，這均不利于代謝產物的積累與產出。 培養基中的金屬離子對于菌株的生長也是極其重要的。脯氨酸羥化酶屬于α-酮戊二酸家族，該家族的酶在作用過程中需要亞鐵離子的參與[5]，亞鐵離子的濃度會影響該酶的羥化作用。 接種體積分數、 培養基的pH 以及培養溫度等對于菌株的生長以及目的蛋白質的表達均是至關重要的。

重組大腸桿菌的生長狀況直接關系到代謝產物生產情況，且工業化生產多采用高密度發酵的方法，溶氧是高密度發酵過程中的一個關鍵因素。 研究[11]表明，通過引入透明顫菌血紅蛋白VHB 基因，可以顯著改善重組菌體的生長狀況和增強外源蛋白質的表達。 透明顫菌血紅蛋白以氧合態參與到有關氧的代謝，在細胞質中，透明顫菌血紅蛋白可以把氧傳遞給呼吸鏈， 提高代謝中氧化磷酸化的效率，進而改善低溶氧下的代謝途徑，促進蛋白質的表達[12]。 Khosravi 等[13]將透明顫菌血紅蛋白VHB 基因引入到表達α-淀粉酶的重組大腸桿菌中，與未引入VHB 基因的菌株相比，α-淀粉酶提高了2.3 倍。因此，可以把VHB 基因引入重組大腸桿菌中，以改善重組菌株的生長狀況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒本實驗用到的菌株及質粒見表1。 其中E. coliJM109 作為宿主，質粒pUC19 作為基因表達載體。

表1 實驗所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this work

1.1.2 試劑及儀器主要儀器包括PCR 循環儀、立式高壓蒸汽滅菌鍋、電泳儀、凝膠成像儀、數顯鼓風干燥箱、恒溫搖床、分光光度計、電轉儀、冷凍離心機、發酵罐等，主要試劑見表2。

表2 主要試劑Table 2 Main Reagents

1.1.3 培養基及培養條件LB 培養基：10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L 氯化鈉，pH 7.0～7.2。固體培養基另加2.0 g/dL 的瓊脂粉。

發酵培養基：10 g/L 葡萄糖，15 g/L 胰蛋白胨，3 g/L 磷酸氫二鉀，2 g/L 氯化鈉，1 g/L 硫酸鎂，0.015 g/L 氯化鈣，3 mmol/L 硫酸亞鐵。 初始pH 8.0，培養溫度30 ℃，轉速220 r/min。 氨芐青霉素50 μg/mL。

1.1.4 引物設計本實驗所用引物序列見表3，由上海生工合成。

1.2 重組大腸桿菌的單因素及正交優化

1.2.1 發酵培養基組分的單因素優化優化過程中除了優化的因素，培養基中其他成分與初始培養基保持一致不變。 每組做三個平行，結果取平均值。

表3 本實驗所用引物Table 3 Primers used in this work

1）碳源種類及質量濃度的優化：分別選擇葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉作為碳源，質量濃度為5、10、15、20、25 g/L。

2）氮源種類及質量濃度的優化：分別選擇胰蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、玉米漿作為氮源，質量濃度為5、10、15、20、25 g/L。

3） 離子濃度的優化：Fe2+的優化濃度分別為0、2、4、6、8 mmol/L，K+的優化質量濃度分別為0、1.5、3、4.5、6 g/L，Na+的優化質量濃度分別為0、1、2、3、4 g/L，Mg2+的優化質量濃度分別為0、0.5、1、1.5、2 g/L，Ca2+的優化質量濃度分別為0、0.05、0.01、0.015、0.02 g/L。

1.2.2 發酵培養基組分的正交優化根據單因素的優化結果，選擇7 個因素作為正交試驗的考察因素，每個因素設3 個水平，使用L18（37）正交表進行實驗設計。

每組做三個平行，發酵結果取平均值。 未選中的因素，以其單因素優化后的結果作為固定值保持不變。

1.2.3 發酵培養條件的優化發酵培養基初始pH的優化： 發酵培養基的初始pH 分別調至5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，進行發酵優化篩選；培養溫度的優化：培養溫度分別選擇26、28、30、35、37 ℃， 進行發酵優化篩選；接種體積分數的優化：接種體積分數分別為2%、4%、6%、8%和10%，進行發酵優化篩選。

1.3 含透明顫菌血紅蛋白基因的重組大腸桿菌的構建

1.3.1 大腸桿菌化轉感受態制備方法大腸桿菌化轉感受態的制備方法參照文獻[14]。

1.3.2 大腸桿菌感受態細胞的轉化方法重組大腸桿菌感受態細胞的轉化方法采用熱擊法[15]。

1.3.3 含VHB 基因的重組質粒的構建為了便于基因操作，以透明顫菌血紅蛋白基因為模板，利用引物P1、P2 在基因VHB 前后插入酶切位點BamH I 和PstI，進行PCR 擴增。 將擴增得到的VHB 基因連接到重組質粒pUC19-BH （pUC19-proB2Aptrp2-hyp）上，構建重組質粒pUC19-proB2A-ptrp2-hyp-VHB（pUC19-BHV），構建過程見圖2。

圖2 重組質粒pUC19-BHV 的構建過程Fig. 2 Construction of recombinant plasmid pUC19-BHV

1.3.4 重組菌株的擴大培養本研究重組菌株的擴大培養條件為：采用優化后的培養基，選擇4 L 的裝液量， 控制發酵過程的pH 為6.5， 設定轉速為400 r/min，設定通氣量為2 vvm，接種體積分數及發酵溫度均以優化結果為準。發酵12 h 后開始補充碳源，補碳方式為勻速補料，速度為24 g/h，碳源依據優化結果而定[14-15]。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量的測定取適量的發酵液， 用去離子水稀釋相應倍數，并以去離子水為空白對照，使用分光光度計測定600 nm 波長處的吸光度值（OD600）。

1.4.2 L-脯氨酸的含量測定L-脯氨酸的檢測采用酸性茚三酮顯色法[14]：取適量發酵液進行離心，取1 mL 上清液或上清稀釋液于10 mL 試管中； 向每管樣品中加入1 mL 冰醋酸，混勻；再加入1 mL 酸性茚三酮試劑，搖勻，沸水浴1 h；取出試管，加入2 mL 冰醋酸；使用分光光度計測定515 nm 波長處的吸光度值（OD515）。

1.4.3 反式-4-羥脯氨酸積累量的測定反式-4-羥脯氨酸的檢測采用氯胺T 法[16]：將發酵液離心后，取2.5 mL 上清液或上清稀釋液于10 mL 試管中；向每管樣品中加入1 mL 氯胺T，搖勻，室溫靜置20 min；再加入1 mL 顯色劑，搖勻；置于60 ℃水浴鍋中，20 min 后取出冰水冷卻； 使用分光光度計測定560 nm 波長處的吸光度值（OD560）。

1.4.4 脯氨酸羥化酶酶活的測定反式-4-羥化酶全細胞酶活測定方法參照文獻[14]。1 個單位酶活被定義為1 min 將1 nmol L-脯氨酸完全轉化為羥脯氨酸的酶量，單位為U，全細胞酶活指的是每毫克干菌體的酶活，單位為U/mg。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基組分的單因素優化結果

2.1.1 碳源種類及濃度的優化結果發酵培養基中的碳源是菌種生命活動所需能量的來源，且可以作為菌體構成及其代謝產物的物質基礎。 根據材料與方法1.2.1， 對碳源的種類及質量濃度進行優化，結果見圖3。

從圖3 可以看出， 當擇麥芽糖作為碳源時，麥芽糖質量濃度為15 g/L 時，羥脯氨酸的產量達到最大值1 019.427 mg/L，高于其他質量濃度的碳源。 當麥芽糖質量濃度低于15 g/L 時，與同質量濃度的葡萄糖相比，羥脯氨酸的產量偏低；但當麥芽糖質量濃度高于15 g/L 時， 羥脯氨酸的產量明顯提高，且逐步趨于穩定。

圖3 碳源的優化結果Fig. 3 Optimization of different carbon source

研究表明， 培養基中使用甘油作為碳源時，發酵過程中產生的乙酸的量明顯低于以葡萄糖為碳源的培養基[17]。根據1.2.1 對麥芽糖及甘油的比例進行優化，結果見圖4。

圖4 麥芽糖及甘油的比例的優化結果Fig. 4 Optimization of different ratio of carbon sources

從圖4 可以看出，當麥芽糖質量濃度與甘油質量濃度比例為2∶1， 即碳源為10 g/L 麥芽糖、5 g/L甘油時，羥脯氨酸的產量達到1 156.177 mg/L，高于僅以麥芽糖為碳源的培養基。 這說明適量添加甘油作為碳源有利于提高羥脯氨酸的積累量。

2.1.2 氮源種類及濃度的優化結果發酵培養基中的氮源主要被用于構成菌體的細胞物質以及代謝產物。 根據1.2.1 對氮源的種類及質量濃度進行優化，結果見圖5。

圖5 氮源的優化結果Fig. 5 Optimization of different nitrogen sources

從圖5 可以看出， 當使用胰蛋白胨作為氮源時，羥脯氨酸的積累量明顯高于其他幾種氮源。 這是由于胰蛋白胨與其他氮源相比， 成分較為復雜。本研究中的生產菌株為精氨酸缺陷型菌株，胰蛋白胨中含有精氨酸等多種氨基酸，更有益于缺陷型菌株的生長。 當胰蛋白胨的質量濃度達到20 g/L 時，羥脯氨酸的產量達到最大值1 009.633 g/L。 但是，當繼續增大胰蛋白胨的質量濃度時，羥脯氨酸的產量卻有所下降。 可能是因為高質量濃度的胰蛋白胨中存在較多的色氨酸，這會阻礙色氨酸串聯啟動子的啟動，從而抑制羥化酶基因的表達，進而進一步影響羥脯氨酸的產量。

2.1.3 Fe2+濃度的優化結果在脯氨酸羥基化的過程中，只有與亞鐵離子結合，該酶的活性中心才能發揮其羥基化作用。 Fe2+在配制過程中容易被氧化，添加一定比例的VC 可能有助于Fe2+發揮作用。 根據1.2.1 對Fe2+的濃度進行優化，結果見圖6。

從圖6 可以看出，隨著濃度的增加，無論是只添加Fe2+還是添加Fe2+：VC 的培養基， 羥脯氨酸產量均呈現增長的趨勢， 這說明Fe2+對羥化酶發揮其羥化活性起到了一定作用。 添加Fe2+：VC 的培養基與未添加VC 的培養基相比， 羥脯氨酸產量總是偏高。 VC 有較強的抗氧化作用，VC 的添加可以有效抑制Fe2+的氧化，增強Fe2+的作用。 當Fe2+：VC 濃度為6 mmol/L 時， 羥脯氨酸的產量達到最大值1 154.603 mg/L。

2.1.4 其他離子的優化結果微量離子的調價對于菌株的生長及產物的代謝至關重要。如K+可以促進L-脯氨酸的攝入量；Na+可用于促進L-脯氨酸代謝過程中proP 蛋白的表達， 利于羥脯氨酸的生產；Mg2+及Ca2+可以有效地促進菌株的生長， 從而影響產物的合成。 根據1.2.1 分別對K+、Na+、Mg2+及Ca2+的質量濃度進行優化，結果見圖7。

從圖7 可以看出，K+、Na+、Mg2+及Ca2+的最優質量濃度分別為3.0、3.0、1.5、0.005 g/L 時， 羥脯氨酸的產量達到最大值，且優化過程中發現生物量與羥脯氨酸產量呈現一定的正相關關系。

圖6 Fe2+的優化結果Fig. 6 Optimization of Fe2+

圖7 K+、Na+、Mg2+及Ca2+的優化結果Fig. 7 Optimization of K+，Na+，Mg2+and Ca2+

2.2 發酵培養基組分的正交優化結果

根據單因素的優化結果，選擇麥芽糖、甘油、胰蛋 白 胨、K2HPO4、亞 鐵 離 子（Fe2+∶VC=1∶1）、鎂 離 子（Mg2+）、鈉離子（Na+）這七個因素進行正交試驗。 采用L18（37）正交表試驗，正交因素的水平見表4，正交試驗結果見表5。

表4 發酵培養基成分正交優化試驗因素水平表Table 4 Orthogonal factors of medium optimization

根據正交試驗結果，發酵培養基中各組分對羥脯氨酸產量的影響主次順序為Na+＞胰蛋白胨＞麥芽糖＞K+＞Mg2+＞亞鐵離子＞甘油；各因素的最優組合為：G2C3A2D3F3E1B2。正交試驗過程中，Ca2+的質量濃度保持0.005 g/L。 因此，優化后的發酵培養基的組成為：10 g/L 麥 芽 糖、5 g/L 甘 油、22 g/L 胰 蛋 白 胨、4 g/L K2HPO4、5 mmol/L 亞鐵離子 （Fe2+∶VC=1∶1）、1.7 g/L鎂離子（Mg2+）、3 g/L 鈉離子（Na+）、0.005 g/L 鈣離子（Ca2+）， 進行發酵驗證， 羥脯氨酸產量為1 435.002 mg/L，與優化前相比提高了35.978%。

2.3 發酵培養條件的優化結果

根據1.2.3 依次對培養基初始pH、培養溫度以及接種體積分數進行優化，每優化一個因素，均以優化后的結果為基礎進行下一個因素的優化，結果見圖8。

初始pH 在5.5~8.5 時， 菌體的濃度OD600值以及羥脯氨酸積累量均隨著pH 的增大逐漸升高。 當pH 高于8.5 時，OD600及羥脯氨酸的積累量開始下降；培養溫度在30 ℃以下時，隨溫度升高羥脯氨酸產量逐步提高， 并且30 ℃時羥脯氨酸產量達到最大值。 但是，當溫度高于30 ℃時，羥脯氨酸產量急劇下降。 可能由于較高較低溫度均不利于脯氨酸羥化酶的表達；當接種體積分數為4%時，羥脯氨酸產量高于其它接種體積分數的發酵結果。 然而，當接種體積分數大于4%時， 雖然OD600的值得到提高，但是羥脯氨酸產量卻有所下降。 這可能是由于大量的菌體使得培養基中的營養物質更多地用于菌體的生長，而產物的代謝受到抑制。

最終當培養基的初始pH 為8.5， 培養溫度為30 ℃，接種體積分數為4%時，羥脯氨酸的積累量達到1 602.787 mg/L， 與優化前的918.714 mg/L 相比提高了42.68%。

2.4 含VHB 基因的重組質粒的構建

2.4.1 透明顫菌血紅蛋白VHB 基因的引入根據1.3.2 構建重組質粒pUC19-BHV。將重組質粒轉入大腸桿菌感受態細胞中，挑取生長良好的單菌落進行培養，提取重組質粒，進行單雙酶切驗證，凝膠電泳的驗證結果見圖9。

泳道1 和泳道2 分別為質粒pUC19-BH 及pUC19-BHV 使用BamH I 進行單酶切的結果，獲得單一條帶；泳道3（a）和3（b）分別為質粒pUC19-BHV 和pUC19-BH 使用EcoR I 與PstI 進行雙酶切的結果， 顯示有差別的條帶分別是片段ptrp2-hyp-VHB（1 644 bp）和ptrp2-hyp（1 069 bp），在1 700 bp 和1 000 bp 處看到這兩條條帶，這些條帶的大小均與預期目標片段的大小相符。 單酶切和雙酶切驗證正確的重組質粒，經DNA 測序正確，表明重組質粒pUC19-BHV 構建成功。

表5 正交優化試驗結果Table 5 Result of orthogonal test

2.4.2 重組大腸桿菌JM109ΔargB/pUC19-BHV 的初步發酵將構建好的質粒pUC19-BHV 轉入缺陷型 菌 株E.coliJM109ΔargB， 獲 得 重 組 菌 株JM109ΔargB/pUC19 -BHV。 以 菌 株JM109ΔargB/pUC19-BH 為對照組， 在優化后的發酵條件下進行初步發酵，發酵結果見表6。

從表6 可以看出，無論是OD600、羥脯氨酸產量還是全細胞酶活， 含有基因VHB 的重組菌株JM109ΔargB/pUC19-BHV 均有提高。 雖然不是很明顯，這可能是由于搖瓶發酵過程的缺氧情況并不明顯，透明顫菌血紅蛋白基因在缺氧的情況下才開始作用。 同時， 也可能由于培養基是針對菌株JM109ΔargB/pUC19 -BH 進 行 優 化 的， 菌 株JM109ΔargB/pUC19-BHV 并不能表現出生長優勢。

2.4.3 重組大腸桿菌JM109ΔargB/pUC19-BH 及JM109ΔargB/pUC19-BHV 的擴大培養為了進一步說明基因VHB 的作用， 參照1.3.2 對菌株JM109ΔargB/pUC19 -BH 及 JM109ΔargB/pUC19 -BHV 進行擴大培養，探究7 L 罐中兩株重組菌的生長及代謝情況，結果見圖10。

圖8 初始pH、培養溫度以及接種體積分數的優化Fig. 8 Optimization of different pH，different temperature and different inoculation

圖9 重組質粒pUC19-BHV 的酶切驗證Fig. 9 Digestion verification of recombinant plasmid pUC19-BHV

表6 重組大腸桿菌株羥脯氨酸的產量Table 6 Production of P4H of recombinant E. coli

由圖10 可知， 與不含VHB 基因的菌株相比，含有VHB 基因的重組菌株菌體生長更為旺盛，且羥脯氨酸產量也相對較高。 發酵0~12 h 的過程中，兩株重組菌的菌體生長速度幾乎相同，且羥脯氨酸的積累量非常相近。發酵12~24 h 的過程中，菌體生長速度略有下降，可能是此時發酵培養基中原有的碳源已被耗盡，而用于補料的碳源還不能滿足菌體生長及代謝的需求， 此時含有VHB 基因的重組菌株的羥脯氨酸積累量略高。 發酵24 h 后，兩株重組菌開始表現出差異， 含有VHB 基因的重組菌株的羥脯氨酸合成速率明顯高于另一株重組菌。 發酵44 h 后， 含有VHB 基因的重組菌株進一步展現出它在生長方面的優勢。 高密度發酵的過程中，隨發酵時間的延長，溶氧開始降低，基因VHB 在低溶氧下顯示出優勢。 發酵60 h， 重組菌株JM109ΔargB/pUC19-BH 的羥脯氨酸積累量達到15.894 g/L，而菌株JM109ΔargB/pUC19-BHV 在發酵56 h 時羥脯氨酸產量達到18.312 g/L，相比提高了13.2%。

圖10 JM109ΔargB/pUC19-BH 與JM109ΔargB/pUC19-BHV 的發酵曲線Fig. 10 Fermentation process curve of recombinant E.coli JM109ΔargB/pUC19 -BH and E. coli JM109ΔargB/pUC19-BHV

3 結 語

在無外源添加L-脯氨酸的條件下，作者通過單因素優化及正交優化，獲得了最優的發酵培養基組成及發酵培養條件。 當發酵培養基組分為10 g/L 麥芽糖、5 g/L 甘油、22 g/L 胰蛋白胨、5 mmol/L 亞鐵離子（Fe2+∶Vc=1∶1）、4 g/L K2HPO4、3 g/L 鈉離子（Na+）、1.7 g/L 鎂離子（Mg2+）、0.005 g/L 鈣離子（Ca2+），初始pH 為8.5，培養溫度為30 ℃，接種體積分數為4%，轉速為220 r/min 時， 發酵24 h， 重組大腸桿菌JM109ΔargB/pUC19-BH 反式-4-羥脯氨酸的積累量達到1 602.787 mg/L， 與優化前相比提高了約42.68%。 結果表明，合適的培養基組成以及培養條件更有利于菌株的生長及代謝產物的生成，對于工業化生產來說非常有必要。

在進行發酵培養基成分以及發酵條件優化的過程中， 我們發現重組菌的羥脯氨酸產量與菌濃OD600的值呈現正相關的關系，因此，可以通過增加菌濃OD600的值進一步實現羥脯氨酸產量的提高。透明顫菌血紅蛋白可以以氧合態參與到與氧有關的代謝，在細胞質中，該蛋白質可以把氧傳遞給呼吸鏈，提高氧化磷酸化的效率，改善低溶氧下的代謝活動，促進蛋白質的表達。 本研究將透明顫菌血紅蛋白VHB 基因連接到重組質粒上進行表達，在7 L罐擴大培養時， 含有VHB 基因的重組菌株JM109ΔargB/pUC19 -BHV 羥 脯 氨 酸 產 量 約 為18.312 g/L， 與不含基因VHB 的菌株相比提高了13.2%。 結果表明，基因VHB 的引入可以改善菌體的生長狀況和增強外源蛋白質的表達。

本研究構建的重組菌株可以實現無外源L-脯氨酸添加生產反式-4-羥脯氨酸， 且會在菌株高密度發酵過程中表現出優勢。 利用該菌株進行羥脯氨酸的生產，羥脯氨酸的得率較高，且后期分離純化更為簡單，這使得微生物法生產羥脯氨酸展現出更多的優勢。