放療與腫瘤微環境的相關進展

蘇琳琳 周歡娣 薛曉英

(河北醫科大學第二醫院，河北 石家莊 050000)

手術、放療、化療是癌癥的三大主要治療手段。世界衛生組織(WHO)統計數據顯示，三者對癌癥治療的貢獻率分別為27%、22%、和6%，其中放療的作用與手術相當。另據WHO統計，腫瘤患者中近70%患者需要放射治療。放療會影響腫瘤發生特異性免疫，包括顯著增加 CD8+T細胞啟動〔1〕、增強腫瘤特異性抗原釋放〔2〕、誘導免疫原性細胞死亡(ICD)〔3〕、促使主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ和新抗原表達〔4〕、促進Ⅰ型干擾素(IFN)〔5〕和補體生成〔6〕、提高活化性受體凝集素樣同型二聚體(NK2GD)配體表達〔7〕。放療誘導的ICD會導致胞外鈣網蛋白過表達，并釋放損害相關性分子模型(DAMPs)高機動性組盒(HMGB)1和三磷酸腺苷(ATP)。這些分子可募集并激活抗原提呈細胞，進而啟動與腫瘤特異性抗原相關的T細胞反應〔8，9〕。由此可見，放療與腫瘤免疫微環境的關系十分密切。其中，放療過程中出現的遠隔效應就是這一復雜關系的產物之一。而外泌體作為腫瘤免疫微環境成員之一，對腫瘤的生物學行為及輻射誘導的旁效應影響重大。本文對放療與腫瘤微環境的相關進展進行綜述。

1 放療與外泌體

1.1外泌體概況 細胞可分泌各種酶類、激素、神經遞質、局部介質、血清蛋白、抗體、細胞外基質等成分。此外，還可釋放一些囊泡類物質，細胞釋放到胞外微環境的囊泡主要有三種類型：外泌體、細胞微泡和凋亡小體〔10〕。外泌體是一種膜性結構的囊泡，直徑最小為50～150 nm，來自胞內早期形成的多囊體，可由正常細胞和腫瘤細胞釋放，內含微小RNA、信使RNA、蛋白質和脂質等成分〔11〕。外泌體的生物進程包含四個主要步驟：起始膜形成、胞吞、多囊體形成、分泌至胞外或被溶酶體溶解。因其參與細胞之間的通信交流〔12〕、免疫反應〔13〕和凋亡逃逸〔14〕，近些年最受關注。

1.2放療對外泌體形成分泌及構成的影響 外泌體的前體是細胞膜形成的早期多囊體，釋放到細胞外通過吞噬或膜融合的方式由受體細胞攝取，進而激活細胞內某一特殊過程。電離輻射對外泌體釋放最顯著的兩個影響因素為：輻射誘導的DNA損傷及p53相關通路的激活。放療不僅會直接導致DNA的損傷，還可激活許多相關通路，p53就是其中之一。受環境應力影響的p53蛋白可調節許多基因的轉錄，一些受此蛋白調節的分泌蛋白會參與相鄰細胞的信息交流。Yu等〔15〕應用蛋白質組學的方法探測受照射的細胞培養基中依賴p53通路分泌的蛋白含量，發現培養基中除了已知的p53基因轉錄的蛋白，許多非p53基因轉錄的基因編碼蛋白在激活p53后也有所增加，這些蛋白由外泌體攜帶至胞外。并發現一種由p53調節的基因產物——血清總酸性磷酸酶可提高微環境中外泌體的形成分泌，進而與臨近細胞甚至免疫系統細胞進行信息交流。

外泌體不僅是內含細胞殘骸的質膜性胞外囊泡，還包含某些特殊的分子。ExoCarta 2012數據庫系統總結了不同來源外泌體的分子構成情況，包括外泌體的蛋白質、脂質和RNA〔16〕。外泌體的構成主要取決于分泌細胞的類型，也受分泌細胞暴露條件的影響，其中最主要的暴露因素是電離輻射。有研究認為電離輻射對外泌體構成的影響取決于細胞模型和電離輻射模式的不同：Arscott等〔17〕用4 Gy的電離輻射(IR)照射24～48 h多形性成膠質細胞瘤細胞U87MG，結締組織生長因子mRNA及 胰島素樣生長因子結合蛋白2抗體蛋白表達水平顯著提高；Lehmann等〔18〕用4 Gy的IR照射前列腺癌細胞(22Rv1)96 h，檢測到B7-H3蛋白含量顯著增多；Hurwitz等〔19〕證明經放療的病人血清中熱休克蛋白72含量增多；Jelonek等〔20〕則用以2 Gy的劑量照射人頭頸部鱗癌細胞(FaDu)18 h后，參與翻譯轉錄的蛋白真核起始因子(EIFs)，葉酸水解酶(PSMs)，核糖體蛋白(RPLs)和核蛋白體蛋白(RPSs)、與細胞周期或細胞分裂有關的蛋白(分子伴侶、泛素化相關蛋白和蛋白酶)及細胞信號蛋白核糖基化作用因子(ARFs)，Rab蛋白(RABs)及Ras蛋白(RASs)含量增多，而載脂蛋白類和免疫球蛋白類表達水平則降低。盡管上述研究的對象和結果不同，但一致認為外泌體運載的物質確實反映了電離輻射導致的細胞特定變化。

1.3外泌體的功能及對放療的影響 正常細胞的外泌體參與啟動免疫調節活動。外泌體攜帶的MHC-肽復合物與同源T細胞受體結合激活致敏性CD4+/CD8+T淋巴細胞〔21，22〕，進而協助啟動機體的免疫反應，保護機體免受腫瘤等異物傷害。外泌體激活免疫反應的能力與其攜帶的膜抗原有關〔23〕，免疫效應則取決于細胞的生理狀態〔24〕。

腫瘤細胞分泌的外泌體也可能攜帶免疫抑制肽復合體，通過某些機制抑制機體免疫反應。有研究證明外泌體能夠減慢自然殺傷細胞〔25〕或CD4+/CD8+T細胞〔26〕的增殖、促進骨髓細胞〔27〕和調節T細胞〔28〕的變異，從而抑制或干擾機體的免疫反應，幫助腫瘤逃脫免疫監視，促進腫瘤生長。來自腫瘤細胞的外泌體還與腫瘤的擴散和轉移有關。研究表明〔17〕，照射引起的外泌體特定變化在一定程度上通過加強神經生長因子(NGF)-酪氨酸蛋白激酶(Trk)A及黏著斑激酶(FAK)信號通路的激活促進腦膠質瘤細胞的遷徙和轉移。

近來有研究強調環境應力對外泌體調節細胞間信息交流影響重大，并證明電離輻射可通過不同的信號轉導系統顯著影響細胞之間的信息交流。外泌體通過向周圍或遠處靶細胞傳遞與細胞凋亡、生存、分裂、生長、變異有關的或多重或獨特的信號調節細胞之間的信息交流〔29〕，進而影響腫瘤生物學行為及治療效果。與輻射相關的細胞間信息交流對放療影響最明顯的是輻射誘導的旁效應，是指通過細胞接觸或細胞間通訊將直接受照射細胞的應答傳遞給周圍未受輻射的細胞，后者也表現出與受照射細胞類似的生物學效應〔30～35〕。外泌體在RIBE中發揮著關鍵作用：Al-Mayah等〔36，37〕先后證明受照MCF7 細胞的旁效應，與輻射引起的基因不穩定性和外泌體的含量及其攜帶的RNA、蛋白質息息相關。

此外，受照細胞對外泌體的攝取也受影響。有研究〔38〕表明，暴露于電離輻射的人骨髓源性細胞會通過CD29/CD81絡合物的生成和依賴p38絲裂原活化蛋白激酶的胞吞和胞飲增加對外泌體的攝取。

2 遠隔效應

Mole〔39〕最初描述道，放療的遠隔效應是指照射原發腫瘤，照射路徑外的遠處轉移瘤體也有反應的現象。腫瘤免疫反應的抑制支持了免疫系統對遠隔效應有影響的假設。我們認為遠隔效應是由系統抗腫瘤免疫反應引起的，但這種現象在臨床實踐中很罕見〔40〕。系統免疫反應的缺失是由腫瘤微環境中局部免疫抑制造成的。免疫效應細胞包括骨髓衍生抑制細胞(MDSC)、FoxP3+T調節細胞(Tregs)、抑制性細胞因子(如：轉化生長因子-β、白細胞介素-10)和一些“免疫檢查點”分子，這些會引起局部T細胞抑制〔41〕及樹突細胞的亞最佳啟動。

2.1遠隔效應的臨床證據 放療本身的遠隔效應臨床罕見且目前只有案例報告。繼1953年Mole之后，Ehlers、Rees、Ohba、Wers?ll、Postow、Golden等又先后在乳頭狀腺癌〔42，43〕、肝細胞癌骨轉移〔44〕、腎細胞癌腦轉移〔45〕、黑色素瘤〔46〕、轉移性非小細胞肺癌〔47〕的放療過程觀察并報道了這種效應。最近，Reynders等〔40〕總結了1973～2013年間23例在單獨放療中出現遠隔效應的案例，中位年齡為64.5(28～83)歲，腎細胞癌是最常見的組織類型，原發腫瘤和轉移腫瘤分別占35%、65%，中位劑量為32(12.00～60.75)Gy，1.2～26.0 Gy/f。出現遠隔效應的平均時間是開始放療后5個月(1～24個月)，隨訪結束或疾病進展前13個月。

2.2遠隔效應的基礎研究 遠隔效應確實是由免疫系統介導的。Demaria等〔48〕應用小鼠乳腺癌67NR模型證實了這個觀點，并證明這種效應具有癌種特異性。其在試驗中觀察到放療聯合生長因子Flt3配體(Flt3-L可增加樹突細胞的數量)可在同一小鼠另一相同癌種的瘤體中觀察到遠隔效應，而同一小鼠不同癌種的瘤體、單獨應用Flt3-L或在T細胞缺陷模型中均無此現象；而后又利用小鼠免疫缺陷型轉移性乳腺癌4T1模型〔49〕證實局部放療原位乳腺癌和抑制細胞毒T淋巴細胞相關抗原(CTLA)-4聯合應用可提高對肺轉移癌的控制。Dewan等〔50〕在TSA小鼠乳腺癌模型和MCA38小鼠結腸癌模型中同樣證實分割放療聯合應用CTLA-4抗體才可誘發遠隔效應。

長期以來，我們一直認為局部放療的作用機制為射線對腫瘤細胞的直接殺傷作用，即導致腫瘤細胞DNA損傷。近來有學者證明，放療的“場域”效應也依賴于免疫系統。包括促進腫瘤抗原擴增、改變和表達，激活免疫應答，誘導T細胞應答，調節腫瘤間質細胞等。 Lee等〔1〕應用小鼠模型研究證明放療會顯著增強淋巴組織中T細胞啟動導致原位腫瘤和遠處轉移瘤體通過依賴CD8+T細胞的形式縮小甚至消失，并進一步證明這種由放療啟動的免疫反應和瘤體縮小效果會隨著長期傳統分割放療或輔助化療減弱，卻會因局部免疫治療增強。有研究還證明局部高劑量放療可引發Ⅰ型IFN的產生，進而啟動先天性和獲得性免疫反應攻擊腫瘤〔51〕，但若樹突細胞中缺乏IFN-α/β 受體1則不能將免疫原性的腫瘤細胞抗原呈現給CD8+T細胞〔52〕。

2.3如何增強放療的遠隔效應 免疫治療正在開辟新前景以增強遠隔效應。上文已敘述放療與CTLA-4抗體、放療與Flt3-L聯合應用在小鼠模型中均可促進遠隔效應的出現。研究表明：當前大部分免疫治療通過抑制CTLA-4、程序性死亡受體(PD)-1、TIM3等免疫抑制因子及抑制間質細胞(如 MDSC)來調節腫瘤微環境，促進 T細胞活化和應答〔53〕。因此，PD-1、TIM3、MDSC有可能成為新的免疫位點與放療聯合應用。

在臨床工作中，Postow等〔46〕首次報告了1例黑色素瘤轉移患者放療期間出現的遠隔效應，但在伊匹單抗(一種可以抑制T細胞免疫檢查點的單克隆抗體，CTLA-4) 維持治療期間疾病發生進展。此外，Postow等〔46〕還證明腫瘤縮小和免疫抗體反應具有時間相關性，并發現外周血免疫細胞(骨髓生成抑制細胞和激活的CD8+CD4+T細胞)也有變化〔46〕。此后，又有研究先后〔46，54～57〕報告了黑色素瘤患者在伊匹單抗治療時存在遠隔效應。總結得知，首次注射伊匹單抗和開始放療的時間間隔為1.5～18個月，出現遠隔效應的時間是放療開始后1～6個月。Stamell等〔55〕還觀察到在遠隔效應出現期間抗黑色素瘤抗體增加，MAGEA3也伴隨增多，并出現針對癌癥抗原PASD1的新反應。

3 放療如何發展以提高治療效果

電離輻射不但能夠誘發免疫原性癌癥細胞死亡，還作為一種危險因子發放免疫信號排斥腫瘤〔58〕。電離輻射可觸發腫瘤免疫排斥機制，首先將腫瘤轉化為獨特的原位疫苗并激發獲得性免疫反應，通過外泌體及其介導的旁效應和遠隔效應影響原位腫瘤及遠處轉移瘤體。但在許多情況下，僅靠電離輻射不能抵制腫瘤特異性免疫抑制。盡管已觀察到輻射會誘發遠隔效應并調節機體對腫瘤的免疫反應，但這種反應在臨床實踐中很少見。雖然放療本身足以提供細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)對腫瘤抗原交叉啟動的必要信號，但這種輔助作用似乎相對較弱。放療會激活新的抗腫瘤CTLs，但對尚未治療的遠處轉移腫瘤，CTLs通常無法克服腫瘤微環境的免疫抑制作用。

但以上一系列研究已證實無論是放療使瘤體縮小的直接作用機制，還是由外泌體介導的旁效應，亦或遠隔效應均與腫瘤免疫微環境密切相關甚至可通過聯合免疫治療強化放療療效。這給我們一個重大啟示：將系統免疫療法與放療相結合來提高腫瘤的治療效果。而免疫位點、放療模式與兩者結合的時機目前尚無定論，有待進一步研究。