某羊場暴發產氣莢膜梭菌、支原體與大腸桿菌混合感染的診斷

張 森，郭倩妤，湯德元，曾智勇，石遠菊，葉 麗，楊 偉，廖少山

(貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

2019年4月，廣西省某羊場部分羊發病，發病羊表現為精神沉郁、食欲廢絕、喜歡獨處、角落埋頭站立、拉稀、大便出血、病程逐步發展為食欲廢絕，后期大便帶鮮血，衰弱死亡。為查明該養羊場發病原因，通過流行病學調查、臨床癥狀觀察、病理剖檢、細菌分離培養、生化鑒定、藥敏試驗及支原體PCR檢測等方法對送檢的病羊進行診斷，確診該發病羊為羊產氣莢膜梭菌、支原體與大腸桿菌混合感染，現報告如下。

1 發病情況

廣西某羊場的羊存欄數超過 1 000只，圈養管理，2019 年 4 月2日出現個別圈羊有發病現象，發病特點為起病急、病程短、死亡率高，病程2～4 d。發病羊主要表現為精神沉郁、食欲減退、拉稀、大便帶血、體溫升高，并伴有咳嗽、流涕和嚴重喘氣、鼻腔流出大量白色泡沫，四肢無力，站立不穩，突然倒地死亡。截止到4月4日共有46只羊發病，死亡39只，發病羊均表現出相同或相似的癥狀。

2 臨床癥狀

發病羊表現為精神沉郁，少食，進而食欲廢絕，喜獨處，部分羊體溫升高(40.5～41.5 ℃)，呼吸困難且呈腹式呼吸，呼吸次數為55 次/min，咳嗽、流涕。聽診心臟有雜音、肺部有腸鳴音。病程后期發病羊角落埋頭站立，大便帶鮮血，全身肌肉顫抖，四肢無力，逐漸衰弱死亡，病程約2～4 d。該羊場第1個圈37只羊發病后全部死亡，第2個圈羊正在發病，初步懷疑為產氣莢膜梭菌及支原體混合感染。

3 剖檢病理變化

對2只病死羊進行剖檢，發現口鼻有白色泡沫；心臟腫大，心包有積液，內有纖維素樣物；肺部有大理石樣病變；胸膜有纖維素樣滲出物；肝臟腫大充血；膽囊腫大；腎臟腫大且被膜出血；脾臟腫大，有壞死灶；瘤胃臌氣；腸系膜淋巴結腫大；十二指腸、大腸有出血點和大量的出血現象。

4 實驗室檢驗

4.1 細菌的分離培養與形態觀察 無菌操作采集發病羊的血液、肝臟、肺臟、心臟和淋巴結等病料組織進行細菌分離培養，劃線接種于血瓊脂培養基中，分別于37 ℃條件下需氧和厭氧培養 24～72 h觀察。結果在需氧血瓊脂培養基中長出大量光滑、隆起、半透明、灰白色菌落；在厭氧血瓊脂培養基中出現表面光滑、半透明的菌落生長，并出現溶血環，且有些菌落有雙溶血環。分別從需氧血瓊脂培養基、厭氧血瓊脂培養基中挑取單個菌落進行革蘭染色及鏡檢，需氧血瓊脂培養基染色后視野內有兩端鈍圓、革蘭陰性桿菌；厭氧血瓊脂培養基染色后可見視野內有兩端鈍圓、革蘭陽性大桿菌。

4.2 細菌的生化特性鑒定 根據細菌微量生化鑒定管說明書進行操作，從需氧血瓊脂培養基和厭氧血瓊脂培養基中挑取純化培養的菌落，接種于細菌微量生化鑒定管進行生化特性鑒定。結果表明：需氧血瓊脂培養基中細菌對葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、木糖、甘露醇和山梨醇呈陽性；硫化氫試驗、明膠液化試驗呈陰性；靛基質試驗呈陽性。厭氧血瓊脂培養基中細菌對葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和果糖呈陽性，且產酸產氣，對木糖、甘露醇和山梨醇呈陰性；在含鐵牛乳試驗中出現“洶涌發酵”現象；硫化氫試驗、明膠液化試驗呈陽性；靛基質試驗呈陰性。結合細菌培養特性及生化試驗結果，判斷分離菌為大腸桿菌和產氣莢膜梭菌。

4.3 藥敏試驗 無菌操作從需氧血瓊脂培養基、厭氧血瓊脂培養基用接種環各挑取1個純化培養的菌落，分別接種于培養基中，涂勻，選用8種常用藥敏紙片貼在培養基中，分別于37 ℃下需氧和厭氧培養24～48 h后觀察結果，并測定抑菌圈直徑，判斷其藥敏性。

需氧血瓊脂培養基中細菌藥敏試驗結果：多西環素、青霉素抑菌圈直徑<10 mm，屬低敏感；鏈霉素、環丙沙星抑菌圈直徑為12 mm，屬中度敏感；阿米卡星、土霉素抑菌圈直徑為18 mm，屬高度敏感；頭孢曲松和頭孢拉定的抑菌圈>20 mm，屬極敏感。

厭氧血瓊脂培養基中細菌藥敏試驗結果：青霉素、卡那霉素的抑菌圈直徑<10 mm，屬低敏感；頭孢拉定的抑菌圈直徑為11 mm，屬中度敏感；頭孢曲松的抑菌圈為18 mm，屬高度敏感；土霉素、鏈霉素、環丙沙星抑菌圈>20 mm，屬極敏感。

4.4 支原體的 PCR 檢測 采集送檢發病羊的脾臟、肺臟、腎臟、腸系膜淋巴結等，分別選取病變較嚴重的部位混合研磨，用液氮反復凍融3次，再用勻漿器磨20 min后收集勻漿，12 000 r/min 離心 10 min，取上清液按支原體 PCR檢測試劑盒說明書方法(購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，MYCO20170703P)進行支原體PCR檢測。PCR 反應液 16 μL，TapDNA 聚合酶 2 μL，模板 DNA 2 μL，總體積 20 μL。反應程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環;72 ℃延伸 10 min。反應結束后取 5 μL PCR 產物于 1%的 1×TAE 瓊脂糖凝膠中電泳檢測(110V，35 min)，用凝膠成像系統拍照記錄。PCR檢測結果顯示：檢測出602 bp條帶，與預期條帶相符，表明發病羊存在支原體感染。

5 結果

本次試驗對發病羊組織樣品、血液、血清進行了細菌培養、生化試驗、藥敏試驗及支原體核酸檢測，檢測結果顯示，細菌培養及生化試驗檢出產氣莢膜梭菌及大腸桿菌感染，且支原體核酸檢測呈陽性。說明該養殖場羊只發生產氣莢膜梭菌、大腸桿菌及支原體混合感染。

6 防治

針對本羊場目前發病情況，首先應將發病及疑似發病羊進行隔離；對發病羊肌內注射土霉素0.05～0.1 mL/(kg·bw)，2 次/d，連用3 d；同時使用ATP、葡萄糖注射液靜脈注射輔助治療；對所有健康羊立即接種羊三聯四防滅活苗及綿羊支原體氫氧化鋁疫苗；對圈舍及周圍水溝使用燒堿嚴格消毒；同時建議羊場合理搭配飼料，加強營養，保障飼料的新鮮，嚴禁飼喂發霉變質飼料，保證羊腸道正常菌群平衡，提高抵抗力和抗應激能力;對病死羊及其污染物進行無害化處理或深埋焚燒；若有妊娠母羊產仔，產前需加強免疫。

按照以上方法進行處理，3 d后沒有新的死亡病例發生，7 d后該場羊只基本恢復正常，無明顯臨床癥狀羊出現。