TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1檢測在甲狀腺良惡性病變中的鑒別診斷價值

周艷，羅楓，伍世鋼，阮君

廣州醫科大學附屬第六醫院(清遠市人民醫院)病理科，廣東 清遠 511518

隨著人們健康體檢意識的提高及超聲診斷技術的進步，發現甲狀腺小結節而進行手術的病例逐年增加，而甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常見的甲狀腺惡性腫瘤。對甲狀腺手術標本中進行病理檢查，因病變微小或形態學不典型，僅僅通過常規HE染色進行病理診斷具有一定的困難。淋巴結轉移是PTC局部復發的主要因素，淋巴結轉移將增加治療的難度。為了進一步診斷疾病、判斷預后，本研究觀察了免疫組化法檢測甲狀腺過氧化物酶(TPO)、間皮細胞(HBME-1)、細胞角蛋白19(CK19)、半乳糖凝素-3(Galectin-3)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)在PTC與良性病變中的表達水平，探討其在PTC與良性病變鑒別診斷中的價值以及CyclinDl與PTC淋巴結轉移間的關系，為診斷及預后提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集清遠市人民醫院2012—2018年甲狀腺手術病例(甲狀乳頭狀癌和甲狀腺良性病變)533例，均由兩名主治醫師以上職稱的病理診斷醫生根據WHO診斷標準進行診斷。533例病例中包括甲狀乳頭狀癌(PTC)269例(其中乳頭狀微小癌103例)，年齡14～79歲，中位年齡44歲；女性220例，男性49例；單側PTC231，雙側PTC 36例，單側合并峽部PTC 2例。余264例為病理組織形態學需與PTC鑒別的甲狀腺良性病變(BTL)(出現局部濾泡上皮乳頭狀增生，濾泡上皮細胞具有非典型性)。其中包括甲狀腺濾泡增生162例，濾泡性腺瘤81例，橋本甲狀腺炎21例(橋本合并PTC 7例，濾泡性腺瘤合并PTC 3例)。PTC行TPO、CK19、HBME-1標記269例，CyclinD1標記205例，Galectin-3標記209例。良性甲狀腺病變TPO、CK19標記 264例，HBME-1標記253例，CyclinD1標記201例，Galectin-3標記202例。

1.2 研究方法 取石蠟包埋組織，然后進行切片，其厚度為3 μm；其中一張切片行HE染色，其余切片進行免疫組織化學檢測。免疫組化采用EnVision二步法，DAB顯色，蘇木精復染。用已知的陽性切片作陽性對照。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1.3 觀察指標與判定標準 觀察TPO、CK19、HBME-1、Galectin-3、CyclinD1在甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺良性病變組織中的表達。由兩名以上主治醫師及以上職稱的病理診斷醫師進行結果判讀。陽性表達判定標準：TPO、CK19胞膜及胞漿出現棕黃色顆粒為陽性細胞，Galectin-3胞漿著色，HBME-1胞膜著色，CyclinD1胞核著色。按陽性細胞所占百分比判斷，TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1陽性細胞大于10%為陽性，否則為陰性。

1.4 統計學方法 應用SPSS19.0統計學軟件分析數據，兩組間率的比較采用χ2檢驗，均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的五種檢測標記物比較 PTC組的HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1陽性表達率明顯高于甲狀腺良性病變組，而TPO陽性表達率明顯低于甲狀腺良性病變組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 5個指標在乳頭狀癌與良性病變中的表達情況［例(%)]

在免疫組化切片TPO在PTC中呈陰性或局灶弱陽性，正常甲狀腺呈強陽性，良性病變中多呈中-強陽性。HBME-1在PTC多呈細胞膜連續性的中-強表達，在良性病變中陰性或局部弱陽性。CK19、Galectin-3在PTC多呈強表達，在良性病變中多呈陰性，部分良性病變弱-中度或局灶的強表達。CyclinD1在多數PTC病例中呈核彌漫著色，在良性病變中多數呈局部核著色。TPO乳頭狀癌陰性表達，橋本甲狀腺炎陽性表達(圖1)。HBME-1乳頭狀癌陽性表達，橋本甲狀腺炎陰性表達(圖2)。CyclinD1乳頭狀癌陽性表達(圖3)。CK19乳頭狀癌陽性表達(圖4)。

圖1 TPO左下乳頭狀癌陰性表達，右上橋本甲狀腺炎陽性表達(×40)

圖2 HBME-1左下乳頭狀癌陽性表達，右上橋本甲狀炎陰性表達(×40)

圖3 CyclinD1在乳頭狀癌陽性表達(×40)

圖4 CK19在乳頭狀癌陽性表達(×40)

2.2 淋巴轉移與無轉移組患者的CyclinD1比較 CyclinD1標記PTC 205例，淋巴結轉移組55例，無淋巴結轉移組150例。有淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組患者的CyclinD1表達水平分別為92.7%(51/55)、88.0%(132/150)，差異無統計學意義(χ2=0.55，P＞0.05)。

2.3 標記物的靈敏度、特異性、準確度 TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1在PTC診斷的靈敏度、特異性、準確度、陽性預測值和陰性預測值見表2。其中TPO特異性和陽性預測值最高。CK19、Galectin-3靈敏度和陰性預測值最高，TPO、HBME-1、Galectin-3均表現較高的準確度。

表2 5種標記物的靈敏度、特異性、準確度、陽性預測值、陰性預測值比較(%)

3 討論

近年來，甲狀腺乳頭狀癌發病趨勢呈全球化激增，其中甲狀腺乳頭狀微小癌所占比重逐漸上升[1]。PTC的診斷主要是依據病理形態學腫瘤細胞核的特點，包括毛玻璃樣核、核溝和核內假包涵體，還可出現間質纖維組織反應、鈣化及砂粒體。然而很多早期PTC形態學不典型，甲狀腺乳頭狀微小癌≤1.0 cm，有些病變甚至小于0.2 cm，無典型乳頭狀結構，鏡下僅表現為大量膠原纖維中分布著散在的濾泡結構，細胞異型性不明顯，給PTC的診斷提出了很高的挑戰和要求。在良性甲狀腺病變中亦可見到乳頭狀增生的上皮或是豐富密集的濾泡，出現細胞的不典型性，核增大、毛玻璃樣核、核溝等。因此部分病例單純從病理形態學方面來鑒別甲狀腺良惡性存在一定困難。

TPO是一種糖基化血紅素蛋白，主要存在于甲狀腺濾泡細胞游離面，是甲狀腺激素合成通路中的重要物質，在T4和T3合成中起重要的催化作用。TPO基因的一些突變可能與甲狀腺癌的發生有關。本研究發現通過免疫組化方法檢測TPO在正常甲狀腺組織中表達，而在PTC中為陰性或弱陽性，在良性病變中多呈現中等至強陽性表達。在PTC中TPO表達缺失達84.0%，在良性病變僅6.1%缺失，差異有統計學意義，與文獻中報道一致[2-3]。本研究TPO的特異度達93.94%，陽性預測值達93.39%。有報導認為TPO陰性表達是PTC診斷的可靠依據[4]。人骨髓內皮細胞標記物(HBME-1)為單克隆抗體，是間皮細胞微絨毛表面特異性標記物，在腫瘤血管的形成、腫瘤的生長以及腫瘤的轉移中發揮重要作用。以往常被用于間皮來源腫瘤的診斷，但是近些年被用于PTC的診斷中。HBME-1在PTC中高表達，在良性病變中不表達或局灶表達，對PTC靈敏度、特異性均較高，與文獻報道一致[5]。HBME-1陽性表達對PTC的確診具有重要意義[6-7]。CK19是一種低分子量上皮標記，主要存在于單層上皮中。近來應用于PTC的診斷中。本研究發現CKl9診斷PTC的靈敏度最高，與文獻[8]中報導一致。CK19在PTC表達的陽性率為100.00%，且均為彌漫強陽性，在良性病變的陽性率為44.3%，多為局部陽性。CK19對PTC和良性病變的鑒別診斷靈敏度最高100.00%，但特異性最低僅55.56%。CK19的陰性預測值為100.00%，因此有研究[9]認為CK19陰性基本可除外PTC的診斷。Galectin-3是一種和β-半乳糖苷結合的內源性凝集素，在細胞與細胞、細胞與基質之間起特異性黏附作用。具有多種生物學功能，如參與前mRNA剪接、細胞生長調控、細胞粘附、炎癥反應、細胞凋亡，與腫瘤惡性轉化、腫瘤轉移有密切關系[10]。本實驗顯示Galectin-3在PTC中多呈陽性，在良性增生病變陰性或局部陽性，與文獻報導一致[11]。Galectin-3鑒別甲狀腺良惡性腫瘤靈敏度為98.56%。有研究將免疫組化應用于甲狀腺細針穿刺標本，發現Galectin-3和CK19也診斷PTC最敏感的標記物[12]。甲狀腺乳頭狀癌組CyclinDl蛋白表達高于甲狀腺良性病變組，提示細胞增殖在甲狀腺惡性腫瘤中增快。有早期觀察發現出現轉移的PTC其獨特的免疫組織化學表型為p27表達的缺失及cyclin D1的高表達,cyclin D1陽性表達等因素是PTC出現淋巴結轉移和預后較差的危險因子[13]。此外，也有一些研究發現CyclinDl蛋白的表達與PTC淋巴結轉移無明顯關聯性[14-15]，與本實驗結果一致。因文獻報導不盡相同，待下一步更大樣本量及更多臨床病理因素的分析。有大量觀察顯示PTC出現頸部淋巴結轉移的高危因素包括：男性、發病年齡＜45歲、腫瘤大?。? mm、甲狀腺外浸潤、雙側病變、多灶性、BRAF(V600E)突變、人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)突變陽性、病理分期3期/4期[16]。

本研究應用免疫組化技術，發現PTC組患者TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1的陽性表達率與B TL組患者比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)；TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1用于PTC診斷時的靈敏度分別是84.01%、86.62%、100.00%、98.56%、89.26%，特異性分別是93.94%、86.56%、55.56%、73.76%、71.14%；CyclinD1在淋巴結轉移組的陽性率與無淋巴結轉移組的陽性率比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。以上研究結果說明TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1在PTC與良性病變中的表達差異顯著，認為免疫組化技術是診斷PTC非常必要的手段。

綜上所述，PTC的診斷及鑒別診斷中，在病理組織形態學的基礎上，檢測TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1可提高PTC的確診率，有效避免漏診及誤診。