皮敏消膠囊的抗炎抗過敏作用機制研究

叢林 周子力 馮濤 馬志躍

[關鍵詞]皮敏消膠囊;抗炎;抗過敏;藥理機制

皮敏消膠囊屬于中藥制劑，能夠發揮祛風除濕、清熱解毒、涼血止癢、消腫散結等效果[1]，目前已經被證實具有治療濕疹[2]、慢性蕁麻疹[3-4]的作用，以及對多種皮膚疾病例如玫瑰糠疹[5-6]、銀屑病[7-8]、皮膚瘙癢[9]等都有一定的功效，并且有研究表明，在臨床療效觀察中，皮敏消膠囊具有抗炎、抗過敏作用，能顯著降低患者的免疫球蛋白IgA、IgG、IgM水平，改善患者炎癥狀態，炎癥因子降鈣素原（Procalcitonin，PCT）、C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）水平也顯著下降[10]。盡管皮敏消膠囊的臨床療效已經被證實，但是關于皮敏消膠囊的藥理作用機制研究目前仍為不足。本次主要對皮敏消膠囊的抗炎、抗過敏作用機制進行了研究。

1 材料和方法

1.1 試驗藥品：皮敏消膠囊（四川德峰藥業有限公司，批號：180612）;醋酸地塞米松（浙江仙據制藥股份有限公司，批號：1805088）;阿司匹林腸溶片（石藥集團歐意藥業有限公司生產，批號：180722）。

1.2 試劑：伊文思藍、INF-γ、IL-4Elisa試劑盒、醋酸、二甲苯、卵白蛋白、NOS分型試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒、TNF-α蛋白抗體。

1.3 試驗動物：昆明種普通級小鼠，雌雄兼用;SD清潔級大鼠，雌雄兼用。

1.4 試驗細胞：LO2人源正常細胞。

1.5 儀器：萬分之一電子天平，低速自動離心機，超聲細胞破碎儀，酶標儀，紫外分光光度計，超低溫冰箱。

1.6 實驗方法

1.6.1 急性毒性試驗：取昆明種健康小鼠10只，雌雄各半，以梯度濃度方式給藥10g/kg、25g/kg、50g/kg、100g/kg、200g/kg，每個濃度雌雄各一只，以灌胃方式給藥，連續觀察14d，詳細記錄動物反應情況。

1.6.2 對小鼠耳廓腫脹的影響：取健康雄性小鼠，按體重隨機分層為3組，每組3只，分別給予藥物10g/kg、5g/kg、2.5g/kg作為試驗組，以阿司匹林腸溶片（0.5g/kg）作為陽性對照組，以蒸餾水作為陰性對照組。各組灌胃給藥3d，1次/d。末次給藥后20min于小鼠右耳涂抹50μl二甲苯，10min后處死小鼠，沿耳廓邊緣剪下左右兩耳，用內徑6.5mm的打孔器打下相同部位的左右二耳，稱重并以兩耳重量差為腫脹度。腫脹抑制率=（陰性對照組小鼠耳廓腫脹度-陽性對照組小鼠耳廓腫脹度）/陰性對照組小鼠耳廓腫脹度×100%。

1.6.3 對小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響：取健康雄性小鼠，隨機分為3組，即皮敏消組（10g/kg、5g/kg、2.5g/kg）、蒸餾水組、阿司匹林組，各組灌胃給藥3d，1次/d。末次給藥后在各組小鼠尾處靜脈注射1%伊文思蘭溶液，注射量為0.1ml/10g，同時腹腔注射0.5%醋酸溶液0.1ml/只，于注射醋酸溶液后30min處死小鼠，用20ml生理鹽水沖洗腹腔，收集洗液，2 000r/min，離心10min，吸取上清液于590nm處測定吸光度值，以吸光度值反映小鼠腹腔毛細血管通透性的改變。

1.6.4 對大鼠血清中IL-4、INF-γ含量的影響：取大鼠30只，隨機分成3組，即蒸餾水組、皮敏消膠囊組（10g/kg、5g/kg、2.5g/kg）、阿司匹林組，每組10只。以生理鹽水配制Al（OH）3懸液（10g/L），陰性對照組每次每只大鼠腹腔注射lml;其余各組大鼠均腹腔注射等量卵白蛋白與Al（OH）3懸液（1ml）的混合液進行初次免疫，第10天重復1次。從初次免疫后第6天開始給藥或蒸餾水，共9d，每日1次。末次給藥后30min，在大鼠在未處死前于腹腔主動脈處取血，室溫靜置1h，待血清析出后，3 500r離心10min，取血清，分裝后-20℃冰箱凍存待行ELISA檢測。采用大鼠IFN-γ、IL-4酶聯免疫試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作，測定血清中IFN-γ、IL-4的吸光度，根據標準曲線，計算濃度。并比較IFN-γ/IL-4的變化。

1.6.5 皮敏消膠囊對模型動物NO/NOS通路的影響：取9只大鼠，隨機分組，每組3只。以生理鹽水配制Al（OH）3懸液（10g/L），陰性對照組每次每只大鼠腹腔注射lml;其余各組大鼠均腹腔注射等量卵白蛋白與Al（OH）3懸液（1ml）的混合液進行初次免疫，第10天重復1次。從初次免疫后第6天開始，分別給予蒸餾水、皮敏消（10g/kg、5g/kg、2.5g/kg）、地塞米松（5mg/kg），共給藥9d，每日1次，收集炎癥滲出液，按NOS分型試劑盒說明，測定滲出液中NOS、iNOS、NO含量。

1.6.6 肝炎模型的制備及小鼠血漿丙氨酸轉移酶活力的測定：每天2次連續7d灌胃給予皮敏消膠囊水溶液分為低（2.5g/kg）、中（5g/kg）、高（10g/kg）劑量三組，對照組給予蒸餾水，環飽菌素35mg/kg每隔2d腹腔注射。P.acnes負荷于灌胃給藥第3天開始。給藥第7天灌胃后30min尾靜脈注射后注射5μg/kg LPS-PBS溶液。小鼠在LPS注射8h后，在乙醚麻醉下心臟取血，置于肝素處理后的離心管中，3 000r/min離心10min，回收上清液儲存在-20℃用于分析。小鼠血漿丙氨酸氨基轉移酶活性通過賴氏法檢測試劑盒測定。測定原理利用在37℃及pH7.4條件下，作用于丙氨酸及α-戊二酸組成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。反應30min后，加入2，4一二硝基苯磷鹽酸溶液，終止反應后492nm下測定OD值。

1.6.7 細胞毒性試驗：將皮敏消溶解于DMSO中，以高劑量（200mg/ml）、中劑量（100mg/ml）、低劑量組（25mg/ml）對照三個組給藥LO2人源正常細胞于96孔板中，每孔LO2正常細胞3 000個，分別培養24、48、72h，加入MTT溶液后培養4h，棄去上清，加入DMSO溶解結晶紫后，于492nm下測定OD值，計算細胞生存率。

1.6.8 皮敏消對小鼠炎癥模型中的血清TNF-α含量的影響：以生理鹽水配制Al（OH）3懸液（10g/L），正常對照組每次每只大鼠腹腔注射lml;其余各組大鼠均腹腔注射等量卵白蛋白與Al（OH）3懸液（1ml）的混合液進行初次免疫，第10天重復1次。從初次免疫后第6天開始，分別給予皮敏消（2.5g/kg、5g/kg、10g/kg），共給藥9d，每日1次并同樣給藥，3 500r/min離心10min，取血清，分裝后-20℃冰箱凍存。后續操作按照Western blot操作進行測定。

1.7 統計學分析：統計學分析采用SPSS 13.0統計軟件進行數據的統計分析，計量資料用（x?±s）表示，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 急性毒性試驗：試驗發現，共有1只動物死亡，出現在觀察期第2天，死亡率10%（1/10）。解剖發現，胃內充滿藥液，腸內也可見。其余部分動物出現精神萎靡，蜷縮等現象。其中，200g/kg、100g/kg試驗組均無其他不適，因此認為該藥物灌胃給藥安全性高。

2.2 對小鼠因二甲苯所致的耳廓腫脹的影響：2.5g/kg皮敏消膠囊組、5g/kg皮敏消膠囊組、10g/kg皮敏消膠囊組及阿司匹林組小鼠的耳廓腫脹程度均低于蒸餾水組，差異具有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 對小鼠腹腔毛細管通透性增高的影響：5g/kg皮敏消膠囊組和10g/kg皮敏消膠囊組小鼠的腹腔洗出液的吸光度值均低于蒸餾水組，差異具有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.4 對大鼠血清中IL-4、INF-γ含量的影響：2.5g/kg皮敏消膠囊組、5g/kg皮敏消膠囊組、10g/kg皮敏消膠囊組及阿司匹林組的IL-4含量均低于蒸餾水組，而INF-γ和INF-γ/IL-4比值均高于蒸餾水組，差異具有統計學意義（P <0.05），見表3。

2 . 5 對NO/NOS通路的影響：2.5g/kg皮敏消膠囊組、5g/kg皮敏消膠囊組、10g/kg皮敏消膠囊組及地塞米松組的NOS、iNOS和NO含量均低于蒸餾水組，差異具有統計學意義（P <0.05），見表4。

2.6 肝炎模型小鼠血漿丙氨酸氨基轉移酶活性：蒸餾水組小鼠血漿ALT（丙氨酸氨基轉移酶）平均值為（24.28±3.47）IU/L，P.acnes-LPS負荷小鼠血漿平均值為（249.58±9.44）IU/L。P.acnes-LPS負荷小鼠血漿活性ALT顯著升高，為肝損傷結果。與模型組相比，不同劑量皮敏消膠囊組血漿ALT水平顯著降低。低（2.5g/kg）、中（5g/kg）、高（10g/kg）劑量組小鼠血漿平均值分別為（178.44±3.69）IU/L、（148.47±6.99）IU/L及（134.79±9.96）IU/L。與模型組相比，皮敏消膠囊對小鼠血漿水平抑制率分別為21%、38%、47%，且呈一定量效關系。

2.7 細胞毒性試驗：高劑量（200mg/ml）、中劑量（100mg/ml）、低劑量組（25mg/ml）三個劑量組下細胞存活率都接近100%，即幾乎無死細胞生成，無明顯生長抑制作用，提示皮敏消膠囊對于人源正常肝細胞LO2無毒性作用。見圖1（數據由Graphpad prism生成，圖表平均值為三時間段平均值）。

2.8 炎癥小鼠血清中TNF-α的含量：由圖2可知，皮敏消膠囊顯著調低了炎癥小鼠中TNF-α的表達量。

3 討論

皮敏消膠囊屬于中藥制劑，主要成分包括：蒼術、苦參、荊芥、防風、蜈蚣、白鮮皮、牡丹皮、蒲公英、地黃、黃岑、紫草、蟬蛻、地骨皮等21味中藥;諸藥合用能夠發揮祛風除濕、清熱解毒、涼血止癢、消腫散結等效果[1]，在臨床上常常用于聯合H1組胺抑制劑用于治療慢性蕁麻疹[4]，而對于濕疹也有一定作用[3]。

本次研究中，探討了皮敏消膠囊作為抗炎抗過敏藥物的毒性，明確皮敏消膠囊的安全有效。驗證了，皮敏消膠囊在二甲苯致小鼠右耳腫脹實驗[11]中、在醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加的實驗中均顯示了顯著的作用。通過測定大鼠血清中INF-γ和IL-4的含量，確定了皮敏消膠囊通過調節T輔助淋巴細胞（Th）的細胞因子，影響INF-γ和IL-4的相對含量，從而發揮抗過敏作用[12]。NOS是一種含鐵血紅蛋白酶，與細胞色素還原酶類似，目前研究發現存在三種亞型，即誘生性（iNOS）、內皮型（eNOS）、神經型（nNOS）。其中，iNOS屬于非鈣依賴性酶，內毒素、IL-1、腫瘤壞死因子和干擾素-γ分泌時，可誘導巨噬細胞產生iNOS。iNOS可催化產生一氧化氮（NO）具有抗腫瘤、抗病原微生物等作用。然而iNOS的持續激活，又可以介導過量NO的產生，從而造成過強的免疫應答，導致炎癥、變態反應的產生[10]。本研究表明，皮敏消膠囊也能夠有效地降低NOS、iNOS以及下游的NO含量，從而發揮抗炎效應。本實驗測定了肝炎模型小鼠中ALT[13]的活性，皮敏消顯著的抑制了ALT的升高，一定程度上保護了由于P.acnes-LPS[14]誘導的肝炎細胞，說明皮敏消膠囊確實具有抗炎的功效。實驗還測定了在LO2細胞[15]中測定了皮敏消膠囊的毒性，與預想一樣，皮敏消膠囊并無細胞毒性。另外實驗還通過Westernblot定性檢測了炎癥因子TNF-α[16-17]這個重要指標的含量，結果顯示皮敏消膠囊可以顯著降低TNF-α的含量，從而起到抗炎作用。

在臨床治療中，皮敏消膠囊能夠顯著緩解蕁麻疹、濕疹這類疾病，而對于一些并不典型的皮膚瘙癢、過敏等癥狀，也能夠明顯治療，這與皮敏消膠囊能夠發揮抗炎抗過敏作用有關。在臨床治療中，皮敏消膠囊一般用于與組胺受體抑制劑西替利嗪、特非那定等聯合使用，但也有單獨使用的案例。本研究明確了皮敏消膠囊的藥理作用，從蛋白、細胞、動物三個不同層次水平上闡述了皮敏消膠囊的藥理作用機制，確定了皮敏消膠囊的抗炎抗過敏活性，與很多天然化合物的廣泛藥理活性類似[18-19]，這也為將來皮敏消膠囊的更廣泛的臨床應用打下了基礎。