MicroRNA-501-5p在瘢痕疙瘩中的表達及與eIF3L的靶向關系探討

林簡 劉曉紅 王榮坤 李濤 李娜 陳惠娟

[關鍵詞]瘢痕疙瘩;永生化成纖維細胞系;微小RNA-501-5p;真核翻譯起始因子3L;靶向關系;調控

瘢痕疙瘩主要表現為機體對皮膚創傷進行修復時成纖維細胞的過度增殖，其發生發展受多種基因的調控，并調控多種通路引起病變的進展。目前研究認為其調控的通路有轉化生長因子（TGF）通路、真核翻譯起始因子（eIF）通路及核因子通路等[1]。微小RNA（microRNA）是近年發現的調控病變形成的因子，主要通過調控下游靶基因發揮生物學作用[2]。EIF可以受多種上游因子的調控。真核翻譯起始因子3L（eIF3L）是家族中的重要成員，在調節細胞增殖及膠原合成中有重要的作用[3]。本次在TargetScan數據庫中進行篩選，發現microRNA -501-5p（miR-501-5p）與eIF3L可能具有結合位點（見表1、圖1）。基于此，本實驗應用前瞻性實驗設計，檢測瘢痕疙瘩中miR-501-5p的表達，分析其與eIF3L的靶向關系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料：選擇2018年5月-2019年12月確診為瘢痕疙瘩并行手術治療的患者41例作為觀察組。納入標準：①腫塊隆起于皮膚表面，質硬，表面光滑發亮，界限欠規則，1年內無自然消退跡象;②病變超出原始損傷邊緣，向周圍正常組織發生浸潤，蟹足狀生長;③具有持續性生長、發紅、痛癢等癥狀，無自愈傾向，不能自行消退;④病理學證實瘢痕組織內有膠原及基質成分的大量沉積，成纖維細胞很多，并有分裂像。排除標準：①局部伴癌變者;②伴有嚴重皮膚疾病患者;③伴有風濕免疫性疾病的患者。選擇同期在醫院確診為增生性瘢痕并行手術治療的患者41例作為對照組。納入標準：損傷因素明確、瘢痕色澤紅、質硬，高出皮膚，瘢痕的增殖不超過損傷范圍。選擇同期因體表皮下良性腫物切除術時切取的正常皮膚組織41例作為正常對照組。均留取術后的新鮮組織（-80℃凍存）及石蠟包埋組織。三組性別、年齡及BMI比較差異無統計學意義（P >0.05），見表2。本研究經醫院倫理委員會批準，患者或家屬簽定知情同意書。

1.2 細胞系：永生化成纖維細胞系購自中科院上海細胞庫。取出后于37℃水中解凍，加入5ml培養液，混合，以1 000轉/min離心5min，倒出培養液加入適當的培養基，混合均勻并置于37℃、5% CO2的恒溫箱中培養，待成纖維細胞長至80%～90%，進行細胞傳代，取3～4代用于本實驗。

1.3 方法

1.3.1實時熒光定量PCR檢測：miR-501-5p的表達水平：應用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測3組中miR-501-5p的表達。取出凍存的標本，稱取100mg進行RNA的提取。引物合成由上海萊楓生物科技有限公司完成，miR-501-5p引物上游：5-AAATATGAAACTGATGGCAA-3，下游：5-TCATGAAACTGCGCACT-3。以U6為內參，上游：5-GGAACGAGAAAGATTA-3下游：5-GGAATTCACGAAATTCCG-3。應用逆轉錄法合成cDNA。逆轉錄反應條件：37℃15min;85℃5s;4℃。試劑購自美國ABI和北京百泰克生物技術有限公司。反應程序：95℃5min，1個循環;95℃5s，64℃30s，72℃20s，共32個循環。60℃時采集信號，記錄Ct值，通過2-ΔΔCt法計算目的基因。ΔΔCt=[Ct目的基因（未知樣品）-Ct對照]-[Ct目的基因（校正樣品）-Ct對照]。

1.3.2 免疫組化檢測eIF3L和Ki67蛋白：免疫組化SP法檢測瘢痕疙瘩中eIF3L和Ki67蛋白的表達。eIF3L、Ki67、二抗和DAB均購自武漢博士德生物技術公司。檢測基于石蠟包埋標本。切取4μm切片，嚴格按實驗步驟操作，設陽性對照（上皮細胞為陽性對照）。嚴格按說明書操作，并由同一技師完成操作。eIF3L的陽性部位是細胞質和（或）細胞膜，Ki67的陽性部位是細胞核，選擇5個熱點區（400倍）進行計數，由病理科醫師應用盲法完成，計算陽性率，取平均值。Ki67陽性率亦稱為增殖指數。

1.3.3 雙熒光素酶報告基因實驗：構建eIF3L的3UTR野生型基因序列及雙熒光報告基因表達的載體，構建3UTR突變的雙熒光報告基因表達載體作為對照。共轉染熒光素酶報告基因質粒及miR-501-5p mimics，避光下檢測熒光素酶表達，觀察miR-501-5p與eIF3L的3UTR結合情況。

1.4 統計學分析：應用SPSS 13.0進行分析，計量資料應用均數±標準差表示，兩組間比較應用t 檢驗，多組間比較應用方差分析（SNK法行兩兩比較），率的比較應用卡方檢驗。同時應用Spearman相關分析，均以P <0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組miR-501-5p表達水平比較：觀察組、對照組和正常對照組miR-501-5p表達比較差異有統計學意義（經SNK法行兩兩比較，P<0.05）。見表3、圖2。

2.2 miR-501-5p在不同臨床病理特征分組中的表達比較：觀察組中miR-501-5p的表達在有無家族史及不同病程的分組中差異有統計學意義（P <0.05）。而在不同性別、年齡及Ki67增殖指數的分組中差異無統計學意義（P >0.05）。見表4。

2.3 瘢痕疙瘩組織中miR-501-5p與eIF3L的相關性：免疫組化檢測瘢痕疙瘩中eIF3L表達的陽性率為5%～70%，平均24.5%，相關分析顯示瘢痕疙瘩中miR-501-5p和eIF3L具有正相關性（r =0.69，P=0.024）。見圖3～4。

2.4 eIF3L mRNA的3UTR是miR-501-5p的直接靶點：構建含有野生型eIF3L mRNA 3-UTR序列的pGL3-basic質粒（pGL3-eIF3L-WT）和miR-501-5p結合位點缺失的突變型eIF3L mRNA 3-UTR序列的質粒（pGL3-eIF3L-MT），分別與空載體轉染組、miR-501-5p轉染組的細胞后培養24h，通過雙熒光素酶報告基因試盒檢測熒光素酶的表達。結果顯示miR-501-5p轉染組能引起轉染pGL3-eIF3L-WT的細胞系中熒光素酶活性降低，而對pGL3-eIF3L-MT組熒光素酶活性無明顯影響，提示eIF3L mRNA的3UTR是miR-501-5p的直接靶點。見圖5。

3 討論

瘢痕疙瘩是一種皮膚的良性增生性疾病，具有惡性腫瘤向周圍正常組織浸潤性生長的特點，可以長在體表的任何部位并且伴有難以忍受的瘙癢和刺痛感，嚴重影響患者的生活質量。此外，瘢痕疙瘩組織易發生感染、破潰，甚至癌變為瘢痕癌。近年研究發現瘢痕疙瘩病變組織中與腫瘤生長相關的基因可以出現異常失調[4-5]。MicroRNA表達失調可能是瘢痕疙瘩中重要的分子進展因素。有研究顯示miR30a 5p通過靶基因BCL2調控瘢痕疙瘩的細胞凋亡和增殖，其可能是治療的重要靶點[6]。miR-501-5p是在基因庫中篩選出來的，主要是與瘢痕疙瘩病變的形成和進展有關[7-8]。miR-501-5p對下游的增殖因子和凋亡因子有明確的調控作用，也是其發揮作用的重要方式[9-10]。

本研究結果顯示瘢痕疙瘩中miR-501-5p的表達明顯高于對照組和正常對照組，提示miR-501-5p高表達是引起瘢痕形成的重要促進因子。結果顯示miR-501-5p的表達與家族史有關，其與遺傳因素及家族聚集性發病特征的具體機制有待更深入的實驗證實。結果顯示miR-501-5p與病程有關，提示miR-501-5p與瘢痕疙瘩的生長密切相關。病程長的患者病變體積大，病變細胞增殖活躍且具有較多的粗大膠原，因此miR-501-5p與病程的相關性可能與病變生長過程中膠原的形成及病變增長密切相關[11]。瘢痕疙瘩的浸潤性生長與其具有腫瘤性浸潤性生長的特點有關，miR-501-5p高表達對瘢痕疙瘩生長的作用可能與miR-501-5p對腫瘤浸潤性生長的作用相似[12]。研究發現miR-501-5p與eIF3L呈正相關性，提示二者具有協同正向作用，雙熒光素酶基因報告實驗驗證了miR-501-5p與eIF3L的靶向作用，提示二者的通路作用存在，miR-501-5p為eIF3L的上游因子。EIF3L在病變形成中具有促進細胞增殖和抑制凋亡的作用，其高表達可以引起病變的生長[13]。由于eIF3L可能是調節翻譯的重要蛋白，因此瘢痕形成過程可能更多依賴于細胞翻譯后的調控作用。本研究是在基因學及組織學的角度的進行的研究，由于eIF3L在作用過程中與基質金屬蛋白酶等因子有關，因此eIF3L對細胞膠原化的形成及纖維細胞的增生可能具有明確的促進作用。有研究顯示瘢痕疙瘩組織內部呈現乏氧狀態，eIF3L與缺氧相關蛋白VEGF和HIF-1a均有關[14]，提示eIF3L在病變進展中的作用可能涉及多種細胞因子間的聯合作用。作為上游因子的miR-501-5p對eIF3L具有的調控作用調節著細胞增殖、膠原化形成、缺氧后膠原的增生等生物學過程[15-16]，但是其具體通路后續研究中應當繼續關注。

總之，瘢痕疙瘩中miR-501-5p高表達，與家族史及病變增生程度相關，miR-501-5p與eIF3L的表達具有靶向關系。