Gasdermin D的結構功能及在病原感染防御中的作用

李嘉琪，周作勇,2，王芝英,2

(1.西南大學動物科學學院，重慶 榮昌 402460；2.重慶市獸醫科學工程研究中心，重慶 榮昌 402460)

Gasdermin D(GSDMD)蛋白屬于Gasdermin(GSDM)家族，是介導細胞焦亡(Pyroptosis)的重要蛋白[1]，在先天免疫防御和致死性內毒素血癥中有重要作用。本文主要對GSDMD的結構特點、介導細胞焦亡和IL-1釋放的機制，以及在病原體感染防御中的作用進行綜述。

1 GSDMD蛋白概述

1.1 GSDMD結構 GSDMD分子量為53 kD，約含480個氨基酸，包括2個結構域，GSDMD的C端結構域(GSDMD-C)和GSDMD的N端結構域(GSDMD-N)，GSDMD-C為包含9個α-螺旋被反向平行的β12-β14覆蓋的球狀結構，GSDMD-N的核心是延伸、扭曲的β-折疊，域間存在2個相互作用位點[1-6]。GSDMD-C對GSDMD-N發揮抑制作用，GSDMD-C的第1個環(276～296AA)插入至GSDMD-N中，在穩定自抑制中起重要作用，接頭序列替換該區域后細胞死亡水平上升[7]。由于GSDMD在原生狀態下易形成高階低聚物，目前尚未獲得GSDMD高分辨率三維結構信息。GSDMA3與GSDMD的同源性達70%，Ding J等[5]根據同源性建模預測GSDMD的結構，如中插彩版圖1。

1.2 Gasdermin家族 GSDMD是約有45%序列同源性的GSDM家族蛋白，GSDM家族在脊椎動物中保守[3-4]。人類GSDM家族包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和DFNB59，小鼠無GSDMB，但是有3個GSDMA同系物(GSDMA1～3)和4個GSDMC同系物(GSDMC1～4)[1]。在GSDM家族中，除DFNB59外都存在雙域結構，能在細胞焦亡中形成膜孔的Gasdermin的N端結構域(GSDM-N)是最保守的結構域[5]。由此，細胞焦亡可重新定義為由GSDM介導的程序性壞死。可能由于結構域間作用位點、作用模式不同，GSDM家族中其他蛋白尚未被發現能作為炎性Caspase底物[1,8]，是否能夠釋放GSDM-N介導細胞焦亡有待進一步研究。

2017年首次發現，在TNF或化療藥物誘導下，GSDME的N端結構域釋放，使半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)介導的細胞凋亡切換為細胞焦亡，敲除Gsdme基因小鼠可避免化療帶來的組織損傷和體重減輕[9]。其他GSDM蛋白的GSDM-N激活機制與功能仍待探索，Gsdmb基因等突變致病(尤其以炎癥為特征的疾病)是否由于釋放了有成孔活性的GSDM-N并觸發細胞焦亡，可作為研究致病機制新方向。

2 GSDMD調控細胞焦亡

2.1 切割GSDMD釋放細胞焦亡活性片段GSDMD-N 目前，GSDMD激活細胞焦亡主要有經典和非經典2條路徑。經典路徑由Caspase-1介導，炎性體識別病原微生物、內源性威脅后招募激活Caspase-1，活化的Caspase-1特異性切割GSDMD[1]。也有研究表明，未被激活的Caspase-1前體同樣可切割活化GSDMD，GSDMD的切割與Caspase-1的激活可能是平行過程[3]。非經典路徑中，小鼠Caspase-11及其人直系同源物Caspase-4、5與LPS直接結合發生寡聚活化，切割GSDMD后破壞其自身抑制作用，得到GSDMD-N和GSDMD-C[1-2]。GSDMD-N誘導巨噬細胞的細胞焦亡，GSDMD和GSDMD-C則毒性較小，未表現出誘導細胞焦亡的功能[1,3,5]。因此，真正引起細胞焦亡的是GSDMD-N，GSDMD-C可通過與GSDMD-N結合，抑制細胞焦亡。最近研究發現，耶爾森氏菌感染巨噬細胞后，其毒力蛋白YopJ通過抑制轉化生長因子激酶1(TAK1)，活化Caspase-8并切割GSDMD，誘導細胞焦亡[10]。而中性粒細胞中，彈性蛋白酶(Neutrophil elastase，ELANE)可切割活化GSDMD，釋放GSDMD-N，誘導中性粒細胞溶解性死亡，其切割位點位于Caspase切割位點上游[11]。

2.2 GSDMD-N片段形成膜孔觸發細胞焦亡 顯微成像發現，GSDMD-N由細胞質靶向細胞膜，細胞出現特征性的膨脹氣泡并破裂[5]。GSDMD-N可與真核細胞膜上特有的磷酸化磷脂酰肌醇和原核細胞膜上特有的心磷脂結合，并在含有磷酸肌醇、心磷脂的脂質體或是天然極性油脂混合物的脂質體上廣泛成孔[5,12]。由于磷脂酰肌醇在質膜上的不對稱分布，GSDMD-N只從內部引起哺乳動物細胞裂解，不會傷害鄰近哺乳動物細胞[12]。GSDMD-N通過電荷-電荷相互作用寡聚化，形成約16元對稱原體(Protomers)的分子孔道，內徑為10～16 nm，該孔徑大小可允許成熟的IL-1β、IL-18通過[5,7]。孔道形成過程中無需其他蛋白作為膜受體或輔助因子，形成后可破壞細胞膜的正常滲透屏障，水和離子涌入，細胞體積增大、腫脹破裂，觸發細胞焦亡[6,13]。目前，GSDMD未顯示與任何已知的成孔毒素有顯著同源性，GSDMD孔道的高分辨率結構未知。

3 GSDMD調控IL-1釋放

IL-1家族的細胞因子是胞質蛋白，釋放至胞外后表現促炎活性。其中，IL-1β成熟分泌是經典炎性體激活的主要反應之一。研究表明，激活炎性體后，Gsdmd基因缺失巨噬細胞不能完成IL-1β 的成熟分泌[1]。進一步觀察鼠傷寒沙門菌感染的Gsdmd基因缺失巨噬細胞發現，胞內成熟IL-1β的分泌受到抑制[1]。由此確認，GSDMD不影響IL-1β成熟，但在成熟形式IL-1β分泌中起重要作用。

通常認為IL-1釋放過程發生細胞死亡之后，但最新研究表明，巨噬細胞可達到超活化狀態，在分泌IL-1的同時仍保持活力，GSDMD孔道對于IL-1β通過完好的脂質雙分子層和分泌IL-1β是必需的[14]。GSDMD孔道除介導細胞焦亡外，可能是巨噬細胞在超活化條件下分泌細胞因子的通道。

4 GSDMD在病原感染防御中的作用

4.1 GSDMD與細菌性病原感染 最初認為，細胞焦亡可釋放免疫逃避的胞內菌，使其被中性粒細胞吞噬、減少復制，實現防御細菌感染。但最近研究表明，細胞焦亡培養上清液可殺死游離細菌，隨著GSDMD-N的消耗，殺傷作用被抑制，而納摩爾濃度GSDMD-N即可結合并殺死革蘭陰性和革蘭陽性菌[11]。在哺乳細胞內，GSDMD-N的過表達對胞內菌同樣表現殺傷作用[12]。以上試驗結果均提示GSDMD-N有直接殺菌作用，目前已有研究表明，心磷脂可從細菌內膜轉移到外膜，GSDMD-N可能通過靶向裂解細菌外膜，清除細菌[15]。但仍缺乏對GSDMD-N殺菌過程的可視化試驗，同時需要確定GSDMD-N是否對機體控制感染產生重要影響。而心磷脂同樣是線粒體內膜的重要組分，對于GSDMD-N能否裂解線粒體尚無研究。

4.2 GSDMD與病毒性病原感染 GSDMD主要通過介導細胞焦亡，參與機體對病毒感染的先天免疫防御。腸道病毒71型，可通過病毒3C蛋白酶破壞GSDMD-N的完整性，抑制細胞焦亡實現自身復制[16]。炎性體NLRP9識別輪狀病毒后激活細胞焦亡，限制病毒復制，敲除Gsdmd基因將增加對輪狀病毒易感性[17]。黑素瘤缺乏因子2(AIM2)識別人腺病毒后，可激活GSDMD介導的人單核細胞衍生樹突狀細胞焦亡[18]。干擾素誘導蛋白16(IFI16)識別人類免疫缺陷病毒(HIV)反轉錄產物，引起CD4+T淋巴細胞焦亡，嚴重破壞免疫系統，Caspase-1抑制劑使CD4+T淋巴細胞在體外感染HIV時仍保存活力[19-20]。目前GSDMD在CD4+T淋巴細胞耗竭過程中的作用有待證實，有望為治療HIV免疫缺陷提供新靶點。

5 小結與展望

細胞焦亡通路中，炎性Caspase底物GSDMD的發現，改變了以往對細胞焦亡的認知，GSDMD-N作為細胞焦亡直接執行者，通過在膜上成孔實現細胞焦亡特征性的腫脹破裂。目前，GSDMD精細結構及GSDMD-N在膜上形成孔道的結構和生化機制仍需更多基礎研究，比如，巨噬細胞在超活化與細胞焦亡間切換是否與GSDMD孔道形成程度不同有關等，對調節先天免疫功能有重要意義。在宿主防御細菌感染的研究中，盡管GSDMD表現出直接殺死細菌的特性，目前仍需進一步研究確定其應用的廣泛性和對控制體內感染的意義。而GSDMD在參與病原感染防御時，可能介導嚴重、廣泛的內皮細胞焦亡，導致炎癥反應失調，引起急性肺損傷等。對此，Rathkey J K等已研究發現，化學小分子Necrosulfonamide通過結合GSDMD的C191位抑制其寡聚化，從而阻斷細胞焦亡[21]。若能通過控制GSDMD，進一步協調好細胞焦亡程度，可為治療敗血癥等炎癥性疾病提供更多啟示。