仿生提取電感耦合等離子體-質譜法同時測定小兒牛黃清心散中可溶性汞和砷含量

裴海燕，高慧珠，孫密樸，葉盛英，李 麗

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八三醫院藥劑科，天津300142）

小兒牛黃清心散是由天麻、膽南星、黃連、赤芍、大黃、朱砂、雄黃等14 味藥材組方的中成藥，具有清熱化痰、鎮靜止痙的作用，主要用于小兒內熱引起的痰喘急驚、四肢抽搐、神志昏迷等癥狀[1-3]。方中，朱砂可清心鎮驚、安神解毒[4-5]，雄黃可解毒殺蟲、燥濕祛毒[6-7]，二者聯用與該藥的藥效作用一致。但朱砂的主要化學成分為硫化汞（HgS），此外還有少量的游離汞和可溶性汞鹽，如氯化汞、氧化汞等[8-9]。硫化汞化學性質穩定，難溶于鹽酸和硝酸，在人體胃中難以吸收，基本均隨糞便排除，因此口服硫化汞對人體基本無毒。但朱砂中還有少量氯化汞和可溶性汞鹽，具有較大毒性，長期服用會損壞人體肝臟和腎臟，同時對人體中樞神經系統和生殖系統有慢性毒性[10-11]。雄黃的主要成分是硫化砷（As2S2），在人體胃腸道難以吸收，幾乎無毒，但藥材中含有少量的可溶性砷鹽和三氧化二砷（As2O3），是劇毒物質[12-13]。目前，朱砂和雄黃的傳統炮制方法均為水飛法，主要是為了減少可溶性的汞（Hg）和砷（As），降低毒性。小兒牛黃清心散現行標準中無對朱砂和雄黃藥材的質量控制[1]，只有散劑通則的檢查項。本試驗中對該制劑中可溶性Hg 和As 的含量測定進行探討，目前對于Hg 和As 的測定主要有原子吸收光譜法[14-15]、原子熒光法[16]，電感耦合等離子體-質譜（ICP-MS）[17 -18] 法及柱前衍生高效液相色譜法等[19]，參考中國藥典和上述文獻，建立ICP-MS 法同時測定小兒牛黃清心散中可溶性Hg 和As 的含量，可為控制該藥的安全性和有效性，以及對改進其質量標準提供參考。現報道如下。

1 儀器與材料

儀器：PerkinElmer Nexlon300x 型電感耦合等離子體質譜儀（美國鉑金埃爾默公司）；ETHOS UP A 型微波消解儀（美國Milistone 公司）；SHA-B 型恒溫水浴振蕩器（常州金壇友聯儀器研究所）：Sartorius BP210S 型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）。

試藥：小兒牛黃清心散樣品（山東廣育堂國藥有限公司，規格為每袋0.3，批號分別為20181203，20190109，20190201）；汞單元素標準物質[批號為GBW（E）081593，質量濃度為1 000 μg/mL]，砷單元素標準物質（批號為GBW08611 -15105，質量濃度為1 000 μg / mL），金溶液標準物質（批號為GSB 04-1715-2006，質量濃度為1 000 μg / mL）；內標溶液鍺（Ge），鉍（Bi）（質量濃度為1 000 μg/mL），所有單元素標準溶液和內標溶液均購自國家計量科學研究院。KED 調諧液為儀器自帶，購自美國珀金埃爾默公司；65%硝酸為優級純（美國Merk兩合公司）；鹽酸、胃蛋白酶（上海國藥化學試劑有限公司）；水為超純水（電阻率≥18.3 MΩ·cm，美國Millipore 超純水機制備）；液氮為高純液氮。

人工胃液：取稀鹽酸16.4 mL，加水800 mL、胃蛋白酶10 g，搖勻，再加水稀釋成1 000 mL，即得。

2 方法與結果

2.1 質譜條件

ICP-MS 工作參數：RF 射頻功率為1 300 W，等離子體氣體流量為18 L/min；霧化氣流速為0.82 L/min，輔助氣體流量為1.5 L/min，采樣深度為7.2 mm，樣品提升速率為1.0 L/min；液氬壓力為0.7 MPa；脈沖電壓為780 V；樣品沖洗30 s，延遲10 s；調諧模式為碰撞模式KED；數據采集重復測定3 次，測定時As 以Ge 作內標物質，Hg 以Bi 作內標物質進行校正。

2.2 溶液制備

分別精密吸取As 和Hg 2 種單元素的對照品溶液適量，用超純水稀釋成每1 mL 中分別含As 1，5，10，20，40 ng 和含Hg 1，2，4，8，16 ng 的系列標準溶液。分別精密量取內標元素Bi 和Ge 標準溶液（1 000 μg/mL）適量，用超純水稀釋成每1 mL 含Bi 和Ge 0.1 μg/mL 的對照品混合溶液。稱取樣品（批號為20181203）0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50 mL 人工胃液，于恒溫振蕩器中37 ℃振蕩4 h，振蕩頻率150 r/min，取出，置離心機上，以4 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察：取2.2 項下的As 和Hg 2 種元素的混合標準系列溶液，按2.1 項下條件進樣分析，內標進樣管插入0.1 μg/mL 的內標溶液中，同時按從低到高的質量濃度依次將進樣管插入上述2 種元素的混合標準系列溶液中，以3 次讀數的平均值為縱坐標（Y）、相對應的進樣質量濃度（ng/mL）為橫坐標（X）進行線性回歸。得線性回歸方程分別為Y202Hg=0.0071X+0.004 0，r=0.999 2（n=3）；Y75As=0.012 2X+0.008 1，r=0.999 1（n =3）。結果表明，As 和Hg 進樣質量濃度分別在0 ～16 ng/mL 和0 ～40 ng/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2 項下的As 和Hg 2 種元素混合標準系列溶液，分別取其低、中、高3 種不同質量濃度的混合標準系列溶液，按2.1 項下條件測定，每種質量濃度重復測定6 次，記錄測量值。結果Hg 元素的RSD分別為4.02%，2.43%，1.13%，As 元素的RSD分別為3.40%，2.42%，1.21% （n=6），RSD均在5%內，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為20181203）0.2 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液6 份，按2.1 項下條件測定，每份樣品重復測定3 次，分別計算Hg 和As 的含量。結果Hg 和As 的平均含量分別為0.068 6 mg/kg 和0.989 9 mg/kg，RSD分別為3.43%和3.22%（n=3），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為20181203）0.2 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下條件分別于0，1，2，4，8，16，24 h 時進樣測定，記錄測定值。結果Hg 和As 2 個元素的RSD分別為4.04%和2.31%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為20181203）0.1 g，精密稱定，共稱取6 份，置具塞三角錐形瓶中，精密吸取上述Hg 和As 標準品溶液適量，用水稀釋成每1 mL 含Hg 10 ng、As 100 ng 的混合溶液，分別加入上述6 份樣品中，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下條件進行測定，計算回收率和RSD。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取各批樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下條件測定，采用標準曲線法分別計算3 批樣品中可溶性Hg 和As 的含量。結果見表2。

表2 各批樣品中可溶性Hg 和As 的含量測定結果

3 討論

3.1 供試品制備方法

試驗前期，對供試品的取樣量采用正交試驗L9（33）進行了考察。當取樣量過大時，測定時需要多步驟地稀釋，容易導致誤差偏大；樣品量過少，當采用人工胃液提取時，可溶性的Hg 含量太低，測量誤差大，不易獲得準確值。綜合考慮，取樣量為0.2 g 合適。對供試品的提取時間進行了考察，分別在2，4，8，12，24 h 時進行了測定，結果發現，隨時間的延長，樣品中可溶性Hg 和As 的含量增大，但當提取時間超過4 h 時，可溶性Hg和As 的含量變化不大。綜合考慮人體實際服用藥物時間，選擇供試品的提取時間為4 h。Hg 具有較強的吸附性，極易附著在儀器的采樣錐和矩管上，影響As 的測定，因此在樣品中需要加入一定的金元素標準溶液，由于Hg 可與金形成金汞齊，使其溶解，可減少儀器污染，保證測定結果的準確性。

3.2 可溶性Hg 和As 測定

方中朱砂和雄黃2 種藥材均含有游離Hg、游離As和可溶性的汞鹽和砷鹽，毒性較大，不同炮制方法對朱砂和雄黃中可溶性Hg 和As 的含量差異很大，當采用傳統的水飛法進行炮制時，可溶性Hg 和As 含量最低；同時，也可除去藥材中其他部分重金屬及其鹽類，大大降低了藥材的毒性。目前，朱砂和雄黃的炮制主要采用機械化（球磨機）干法研磨，不僅會使Hg 和As 游離出來，同時也不能除去可溶性Hg 和As，以及其他類重金屬，從而導致朱砂和雄黃中毒。孔廣英等[12]通過砷鹽古蔡氏法測得小兒牛黃清心散中可溶性As 含量為0.1% ～0.2%，與本研究結果基本一致。

3.3 ICP-MS 法的優點

ICP-MS 法同時測定多種元素時具有較高的靈敏度和準確性，且具有一次進樣同時測定多個元素的優勢，縮短試驗時間，儀器的靈敏度最高，減少相互之間的干擾，補償基體效應。依據質量數相近、電離電位相近的原則選209Bi 作為202Hg、72Ge 作為75As 的內標溶液，從而減少元素的直接干擾。同時，為了保證結果的準確性、試驗所用容量瓶和大肚吸管均為聚乙烯塑料材質，并采用20%硝酸浸泡過夜洗凈后使用，所有量瓶和大肚吸管均經計量院校準合格后使用。