止咳化痰合劑質量標準改進

徐丹洋，周 謐，張金星，王素素

（江蘇省南通市食品藥品監督檢驗中心，江蘇 南通 226006）

止咳化痰合劑有清熱、止咳、化痰功效，用于治療各種疾病引起的咳嗽、痰難咳出及咳嗽痰多諸癥。該合劑為黃棕色有少量沉淀液體，由陳皮、桔梗、浙貝、黃芩、連翹、前胡、紫菀等11 味中藥飲片及1 味中藥提取物組方，臨床長期使用，效果較好，但一直缺少嚴格的質量控制方法。本研究中通過薄層色譜（TLC）法，對該合劑中桔梗、前胡、浙貝、紫菀4 味中藥進行定性鑒別，通過高效液相色譜（HPLC）法對組方中陳皮、黃芩、連翹3 味中藥進行含量測定，為該制劑的質量控制提供依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000 型高效液相色譜儀（戴安儀器公司）；BT125D 型電子分析天平（賽多利斯公司）；HHS-11-6型恒溫水浴鍋（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；Milli-Q 超純水儀（Millipore 公司）。

1.2 試藥

桔梗對照藥材（批號為121028-201411）、貝母素甲對照品（批號為110750-201612）、貝母素乙對照品（批號為110751-201712）、白花前胡甲素對照品（批號為111711-201703）、紫菀酮對照品（批號為111581-201806）、橙皮苷對照品（批號為110721-201617）、黃芩苷對照品（批號為110715-201720）、連翹苷對照品（批號為110821-201615），均購自中國食品藥品檢定研究院；止咳化痰合劑由本地中醫院提供；乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別[1]

2.1.1 浙貝

取樣品溶液30 mL，置分液漏斗中，加濃氨試液2 mL與三氯甲烷20 mL，振搖提取，取三氯甲烷層蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取缺浙貝的陰性樣品溶液30 mL，同法制成陰性對照品溶液。取貝母素甲對照品、貝母素乙對照品各適量，加三氯甲烷制成每1 mL 分別含上述成分2 mg 的混合對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（四部）》（通則0502）TLC 法（以下簡稱TLC 法）試驗，吸取陰性對照品溶液、對照品溶液各10 μL，供試品溶液、供試品溶液-對照品溶液（1 ∶1，V/ V）各20 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（17 ∶2 ∶1，V/ V/ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。詳見圖1 A。

圖1 浙貝、桔梗、前胡薄層色譜圖

2.1.2 桔梗

取樣品30 mL，加7%硫酸乙醇10 mL，加熱回流1 h，放冷，用三氯甲烷振搖提取2 次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，加水洗滌2 次，每次30 mL，棄去洗液，三氯甲烷液用無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即得供試品溶液。取缺桔梗的樣品溶液30 mL，同法制成陰性對照品溶液。另取桔梗對照藥材1 g，加水50 mL，煎煮1 h，濃縮至30 mL，濾過，取濾液加7%硫酸乙醇10 mL，加熱回流1 h，放冷，用三氯甲烷振搖提取2 次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，加水洗滌2 次，每次30 mL，棄去洗液，三氯甲烷液用無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，即得對照藥材溶液。按TLC 法試驗，吸取陰性對照品溶液、供試品溶液、對照藥材溶液各10 μL，供試品溶液-對照品溶液（1 ∶1，V/V）20 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙醚（2 ∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。詳見圖1 B。

2.1.3 前胡

取樣品30 mL，加石油醚（60 ～90 ℃）振搖提取2 次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，即得供試品溶液。取缺前胡的陰性樣品溶液30 mL，同法制成陰性對照品溶液。另取白花前胡甲素對照品，加甲醇制成質量濃度為0.5 mg/mL 的對照品溶液。按TLC 法試驗，吸取陰性對照品溶液10 μL，供試品溶液、供試品溶液-對照品溶液（1 ∶1，V/V）各20 μL，對照品溶液5 mL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60 ～90 ℃）-二氯甲烷-乙酸乙酯（4 ∶2 ∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。詳見圖1 C。

2.1.4 紫菀

取樣品溶液30 mL，加乙酸乙酯萃取2 次，每次30 mL，合并濾液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取缺紫菀的陰性樣品溶液30 mL，同法制成陰性對照品溶液。另取紫菀酮對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。按TLC 法試驗，吸取上述陰性對照品溶液10 μL，供試品溶液、供試品溶液-對照品溶液（1 ∶1，V/V）各20 μL，對照品溶液5 mL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60 ～90 ℃）-乙酸乙酯（9 ∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點或熒光斑點，陰性無干擾。詳見圖2。

圖2 紫菀薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件[2]

色譜柱：Agilent-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～10 min 時20%A，10 ～15 min 時20%A→25%A，15 ～20 min時25%A，20 ～25 min 時25%A→32%A，25 ～35 min 時32%A→37%A，35 ～40 min 時37%A→42%A，40 ～45 min時42%A→50%A，45 ～50 min 時50%A→90%A，50 ～55 min 時90%A，55 ～57 min 時90%A→20%A，57 ～65 min 時20%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取橙皮苷、黃芩苷、連翹苷對照品30.17，30.23，10.04 mg，精密稱定，置同一100 mL 容量瓶中，加70%甲醇溶解并定容，搖勻，制成各成分質量濃度分別為0.290 0，0.283 0，0.095 3 mg/mL 的混合對照品貯備液；精密量取5 mL，置50 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得混合對照品溶液。精密量取樣品15 mL，置分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取3 次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌3 次，每次30 mL，取正丁醇層蒸干，用70%甲醇溶解轉移至50 mL 容量瓶中，并定容，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。同法制備陰性對照品溶液[3-5]。

2.2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖3。理論板數按各待測成分峰計均大于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

專屬性試驗：取2.2.2 項下混合對照品溶液及陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果在各待測成分峰處陰性對照無干擾，詳見圖3。

線性關系考察：取上述混合對照品貯備液1.0，2.5，5.0，10.0，50.0 mL，分別置50 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得系列混合對照品溶液，分別依次注入高效液相色譜儀，進樣量為10 μL，記錄峰面積。以待測成分對照品質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 回歸方程及線性范圍（n=5）

精密度試驗：取混合對照品溶液，按擬訂色譜條件連續測定6 次。結果橙皮苷、黃芩苷、連翹苷峰面積的RSD分別為0.60%，1.02%，0.89%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，室溫下分別于0，2，4，6，8，12，24 h 時進樣測定。結果橙皮苷、黃芩苷、連翹苷峰面積的RSD分別為1.08%，1.12%，0.97%（n=7），表明供試品溶液室溫下放置24 h 內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批適量樣品5 份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果橙皮苷、黃芩苷、連翹苷峰面積的RSD分別為1.17%，1.29%，1.32%（n=5），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品，分別加入橙皮苷、黃芩苷、連翹苷質量濃度分別為0.301，0.325，0.065 0 mg / mL 的混合對照品溶液2.5，3.0，3.5 mL，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表2。

2.2.4 樣品含量測定

取樣品適量，依法制備供試品溶液，并按擬訂色譜條件進行測定含量。結果見表3。

圖3 高效液相色譜圖

表2 加樣回收試驗結果（n=9）

表3 樣品含量測定結果（mg/mL，n=5）

3 討論

合劑作為一種口服液體制劑，質量可控性較片劑、顆粒劑、膠囊劑等固體制劑差，且在運輸，儲存過程中易發霉、酸敗，但其具有見效快、吸收好的特點，故很多中醫院仍保留較多合劑類醫院制劑[6]。止咳化痰合劑規定了性狀、相對密度、pH、裝量、微生物限度檢查，但與大部分合劑標準一樣只對外部特征進行控制，對能保證藥品療效的鑒別特征和指標性成分的控制較少。

本研究中通過TLC 法確定了組方中4 味中藥的鑒別特征，斑點清晰、分離度好、專屬性強。并建立了組方中3 味中藥的含量測定方法，結果3 個待測成分分離度良好，陰性對照無干擾。本試驗中對該方主要成分有了較嚴格的質量控制標準，保證了臨床用藥的安全性、有效性及合理性，對起到調和藥性及處方中用量較少的其他4 味中藥未設立質控標準。

預試驗中，TLC 法條件參考2015 年版《中國藥典》一部及四部，對提取溶劑、提取方法、展開劑、溫濕度、薄層板、顯色劑等均做系統考察，采用適合的溶劑提取待測成分可排除其他成分的干擾，選取合適的流動相配比可達到較好的分離效果，顯色劑的選擇可排除不同類型化學成分的干擾，最終優化出有顯著鑒別特征的薄層色譜法，且比移（Rf）值在0.3 ～0.7 之間。

HPLC 法中，由于合劑中成分較復雜，故本試驗中考察不同的提取方法：聚酰胺吸附柱色譜法（不同洗脫溶劑：乙醇、甲醇、70%乙醇、70%甲醇，不同洗脫體積：100，120，150，200 mL），正丁醇有效部位萃取法（考察水飽和正丁醇的萃取體積、萃取次數，正丁醇飽和水的洗滌體積、洗滌次數，正丁醇層蒸干后轉移樣品所用溶劑）等對待測成分的提取和純化效果。由于聚酰胺洗脫慢，吸附較大（最高可達30%）[7]，以及不同品質的聚酰胺存在差異，導致試驗結果重復性較差。同時文獻表明，橙皮苷、黃芩苷、連翹苷在正丁醇中均有較好的溶解性[8-10]，故采用正丁醇萃取法來提取指標性成分。系統適用性試驗中考察不同的流動相系統（0.1%磷酸溶液-乙腈，0.1% 磷酸溶液-甲醇）；考察不同品牌（Waters、Agilent、Shimadzu）的色譜柱，最終選定本研究中色譜條件，更好地保障了合劑的質量。