復方佛手口服液澄清工藝改進及含量測定*

張春燕，范 玲，謝星星，朱澤兵，何世新，杜 彪

（1. 西南醫科大學附屬醫院藥物臨床試驗機構，四川 瀘州 646000； 2. 西南醫科大學附屬醫院藥學部，四川 瀘州646000； 3. 重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404000； 4. 重慶三峽中心醫院藥學部，重慶 404000）

目前臨床使用的抗抑郁藥主要為三環類抗抑郁藥物、選擇性5-HT 再攝取抑制劑、單胺氧化酶抑制劑、選擇性NE/5-HT 再攝取抑制劑等[1]，這些藥物普遍存在起效時間長、復發率高、臨床治愈率低且殘留癥狀突出等共性問題。近年來，中藥治療抑郁癥試驗研究取得了較大進展，主要有柴胡、白芍、枳殼、淫羊藿、石菖蒲等單味中草藥，以及常用的中藥復方，如逍遙散、開心散、小柴胡湯、四逆散等[2-3]。抗抑郁中藥從以“單胺類神經遞質學說”為基礎發展到“海馬神經障礙學說”，靶標逐漸關注神經可塑性、神經發生、下丘腦-垂體-腎上腺軸、免疫系統等方向，中藥抗抑郁藥物治療的安全、有效、潛伏期縮短和個體化治療將成為抗抑郁藥研究新的方向[4]。復方佛手口服液（曾用名安康口服液）是由重慶三峽中心醫院多位名老中醫從數百種中草藥中篩選出的以佛手為主藥組方的抗抑郁新制劑。本研究中在已有試驗基礎上對復方佛手口服液的澄清工藝進行改進優化，并提高其質量標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XL-10B 型密封式粉碎機（廣州市旭朗機械設備有限公司）；DL-1 型萬用電爐（北京中興偉業儀器有限公司）；SDLA-B-1101 型實驗室超純水機（重慶圣德利醫療器械研究有限公司）；SHZ-D Ⅲ型循環水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；XMTD 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）；XP204 型電子天平（梅特勒-托利多公司）；SB2200 型超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司）；LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司），CS101-2 型電熱干燥箱（中國重慶銀河試驗儀器有限公司）。

1.2 試藥

佛手飲片（天圣制藥集團重慶有限公司，重慶）；郁金飲片（重慶國中醫藥有限公司，廣西、四川）；北柴胡飲片（重慶慧遠藥業有限公司，陜西）；桑椹飲片（重慶國中醫藥有限公司，四川）；大棗飲片（重慶天圣藥業有限公司，河南）；炒酸棗仁飲片（重慶國中醫藥有限公司，河北）；甘草飲片（重慶慧遠藥業有限公司，內蒙古），藥材均經重慶市萬州區藥檢所副主任藥師張華鑒定為正品。橙皮苷對照品（批號為110721-201316），姜黃素對照品（批號為110823-201706），均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈、甲醇均為色譜純，水為新鮮制備的高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 提取工藝單因素試驗

根據文獻[5]確定了浸泡時間、提取時間、提取次數、加水量為影響因素，確立為單因素考察因素，測定干膏得率、橙皮苷含量，考察其影響因素。初步確定各因素的水平，并進行響應面分析，確定了最優提取條件，浸泡時間34 min，提取時間30 min，加水倍數9 倍。

2.2 樣品制備

按處方量的藥材比例（佛手100 g，郁金90 g，柴胡、桑椹、大棗各45 g，酸棗仁50 g，甘草25 g）稱取復方中藥材，共100 g，將佛手、柴胡、桑椹、大棗、酸棗仁、甘草置圓底燒瓶中，按單因素提取工藝單因素試驗所得最優試驗條件，加入水煎煮藥材，保持微沸至規定時間后停止加熱，過濾水提取液，收集、合并濾液。郁金用10 倍甲醇超聲提取1 h，放冷2 h，將濾液低溫濃縮至一定量。合并總濾液，加蒸餾水定容至1 000 mL，作為濃縮液，備用（復方佛手口服液）。

2.3 澄清工藝優化

2.3.1 澄清劑加入次序確定

通過測定，復方佛手口服液的pH 為4.998。按澄清劑說明書，加樣順序取決于處理溶液的pH 環境，通常蛋白質的等電點為pH=4.8，中草藥水提取液大多數為中性，相對于蛋白質的等電點為堿性環境。澄清劑加入次序的一般原則是，在堿性環境中，按先加入B 組分后加入A 組分順序添加；酸性環境中則相反。本復方佛手口服液澄清劑加入順序確定為先加入B 組分后加入A 組分。

2.3.2 評價指標

通過公式計算干膏得率、橙皮苷保留率。固形物去除率（%） =（澄清前固形物質量-澄清后固形物質量）×100% /澄清前固形物質量，橙皮苷保留率（% ） =澄清劑處理后藥液橙皮苷的含量×100% /處理前藥液中橙皮苷的含量。橙皮苷保留率、固形物去除率按歸一化法測得評價指標OD值，作為綜合評分。采用Hassan 法分別對各指標進行數學轉換，di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）。對橙皮苷保留率、固形物去除率進行數學轉換，求得歸一值OD值[6]，OD=（d1×d2×d3……dx）1/n。

2.3.3 吸附澄清劑選擇

在已有研究基礎上[7]，對復方佛手口服液澄清工藝進行優化，發現天然澄清劑遠優于中草藥的水提醇沉法。本研究中采用新一代純天然澄清劑ZTC1+1Ⅲ型天然澄清劑。天然澄清劑采用“1+1”澄清技術，澄清效率高，安全無毒，價格低廉，生產周期短，使傳統中草藥的水提醇沉工藝得到了簡化[8]。

2.3.4 澄清劑溶液制備

按說明書和文獻[9-10]配置。A 組分溶液：取1.051 5 g A 組分細粉，精密稱定，先用少量去離子水（蒸餾水）攪拌成糊狀，加入需要量的去離子水定容至100 mL，室溫下放置，溶脹24 h 后，攪拌均勻，用雙層紗布過濾，即得1%的粘膠液，備用。B 組分溶液：取1.003 1 g B 組分細粉，精密稱定，先用少量去離子水溶解，再用濃度為0.5%（0.25% ～0.5%）的醋酸溶液1 mL 輔助溶解B 組分，加入去離子水定容至100 mL，溶脹24 h 后，攪拌均勻，用雙層紗布過濾，得1%的粘膠液，備用。

2.3.5 工藝優化

澄清工藝Ⅰ：考察水提醇沉法的澄清效果。取濃縮液10 mL，置50 mL 潔凈錐形瓶中，平行操作3 份（編號1 ～3），分別加入95%乙醇17，19，28 mL，使3 個樣品的含醇量分別為60%，65%，70%。靜置約28 h，用雙層紗布過濾，在水浴鍋上揮干溶劑測得干膏得率，再按質量標準研究項下制備方法準備樣品，并測定橙皮苷含量。詳見表1。

表1 水提醇沉法的澄清結果

澄清工藝Ⅱ：采用正交試驗法L9（34）考察天然澄清劑的澄清效果。考察因素包括澄清劑用量B/A（因素A）、B 加入澄清劑時的溫度（因素B）、靜置時間（因素C）對天然澄清劑澄清效果的影響。計算固形物去除率、橙皮苷保留率，以綜合評分指標OD值作為復方佛手口服液澄清度效果的終點指標。水提天然澄清劑法因素水平見表2，正交試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。最佳澄清工藝：由表3 可見，影響因素對OD值影響由大到小的順序為B ＞C ＞A，加入澄清劑時的溫度對OD值影響最大。篩選出的最佳澄清工藝條件為A1B2C2，即澄清劑用量B/A 為4% ∶2%，加入澄清劑時的溫度為60 ℃，靜置時間為6 h。

表2 正交試驗法因素水平表

表3 水提天然澄清劑法正交試驗設計及結果

表4 澄清工藝方差分析結果

工藝Ⅰ與工藝Ⅱ澄清效果比較：將復方佛手口服液進行澄清后，依次測定干膏得率和橙皮苷含量，計算固形物去除率和橙皮苷保留率。乙醇沉淀工藝和ZTC1+1 澄清技術得到的OD平均值分別為0.327 7 和0.390 2。可見，ZTC1+1 澄清技術優于乙醇沉淀工藝。

2.4 薄層色譜鑒別

2.4.1 佛手

量取樣品10 mL，置清潔干燥的蒸發皿中，置水浴鍋上濃縮蒸干，殘渣加無水乙醇0.5 mL，超聲溶解，作為供試品溶液。另取佛手對照藥材0.5 g，加無水乙醇10 mL，超聲處理30 min 后，濾過，濾液濃縮至干，殘渣加0.5 mL 無水乙醇溶解，作為對照藥材溶液。取不含佛手的陰性樣品溶液10 mL，移入水浴鍋上濃縮，揮干溶劑，殘渣加0.5 mL 無水乙醇溶解，可超聲輔助溶解，作為陰性對照品溶液。另取橙皮苷對照品少量，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。

按薄層色譜法[2015 年版《中國藥典（一部）》通則0502]試驗，用毛細管吸取上述4 種溶液各1 μL，分別點于同一以1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100 ∶17 ∶13，V/ V/ V）為展開劑，展開約4 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20 ∶10 ∶1 ∶1，V/ V/ V/ V）的上層溶液為展開劑，展開約12 cm，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁試液（精密稱取三氯化鋁1.0 g，無水乙醇定容至100 mL），置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液、對照藥材溶液色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾（圖1 A）。

圖1 薄層色譜圖

2.4.2 郁金

量取復方佛手口服液10 mL，置清潔干燥的蒸發皿中，置水浴鍋上濃縮蒸干，殘渣加無水乙醇0.5 mL，超聲溶解，作為供試品溶液。另取郁金對照藥材2.0 g，加無水乙醇20 mL，超聲處理30 min 后，濾過，濾液濃縮至干，殘渣加0.5 mL 無水乙醇溶解，作為對照藥材溶液。取不含郁金的陰性樣品溶液10 mL，移入水浴鍋上濃縮，揮干溶劑，殘渣加0.5 mL 無水乙醇溶解，可超聲輔助溶解，作為陰性對照品溶液。另取姜黃素對照品少量，加入無水乙醇制成質量濃度為20 μg/mL 的溶液，作為對照品溶液。

按薄層色譜法[2015 年版《中國藥典（一部）》通則0502]試驗，用毛細管吸取上述4 種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（96 ∶4 ∶0.7，V/ V/ V）為展開劑，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液、對照藥材溶液色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾（圖1 B）。

2.5 君藥佛手中橙皮苷含量測定

2.5.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠Diamosil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-1.5%冰醋酸溶液（17 ∶83，V/ V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：284 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：284 nm。理論板數按橙皮苷峰計不低于4 000。在此色譜條件下，樣品中提取所得橙皮苷保留時間約為27 min。色譜圖見圖2。

2.5.2 溶液制備

稱取橙皮苷對照品0.102 4 g，精密稱定，置50 mL清潔容量瓶中（質量濃度為195 μg/mL），加入甲醇適量使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備液；將其稀釋10 倍，精密量取對照品貯備液5 mL，置50 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液（19.5 μg/mL）。量取樣品濃縮藥液10 mL，置干凈清潔蒸發皿中，于水浴鍋上濃縮至干，靜置，冷卻至室溫，加入甲醇20 mL，超聲處理40 min，放冷至室溫，濾過，殘渣用10 mL 甲醇分別洗滌3 次，合并濾液，置水浴鍋上濃縮至2 mL，放冷，轉移至10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別按處方比例及制劑工藝制備不含佛手的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.5.3 方法學考察

陰性干擾試驗：比較陰性對照品溶液（不含佛手）、供試品溶液與橙皮苷對照品溶液的色譜圖，在橙皮苷出峰時間相應處陰性樣品溶液無峰出現，分離較好，表明其他組分對橙皮苷含量測定無干擾（見圖2）。

線性關系考察：精密吸取對照品溶液（97.587 2 μg/mL）50，100，200，400，600，800，1 000 μL，分別加甲醇950，900，800，600，400，200，0 μL，配成質量濃度分別為1.714 5，6.961 4，15.157 1，33.677 4，54.727 9，79.767 9，97.587 2 μg/mL 的標準溶液，按擬訂色譜條件測定，以橙皮苷含量為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程Y=18 132.53X，R2=1（n=7）。結果表明，橙皮苷含量在0.017 ～0.975 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液10 μL，連續進樣6 次。結果橙皮苷峰面積分別為304 074，306 836，299 270，297 745，299 864，307 560，RSD=1.38% （n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，精密吸取10 μL，分別于0，2，4，8，12，24 h 時按擬訂色譜條件測定。結果橙皮苷峰面積的RSD=1.76% （n=6），表明供試品溶液在24 h 內穩定。

重復性試驗：取同一樣品，依法制備供試品溶液，平行制備6 份，測定含量。結果的RSD=2.2% （n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱取處方量藥材，加入已知含量的同一供試品溶液（16 μg/mL），平行取樣6 份，分別精密加入對照品溶液（195.174 4 μg/mL）2.5，5，10 mL，依法測定含量。結果平均回收率為96.15% ，RSD=1.61%（n=6）。

2.5.4 樣品含量測定

采用外標法，分別配制對照品溶液和供試品溶液，精密量取10 μL，注入高效液相色譜儀，測定待測成分的峰面積或峰高，按公式CX=AX×CR/AR計算含量，其中CX為供試品溶液質量濃度，CR為對照品溶液質量濃度，AX為供試品溶液峰面積，AR為對照品溶液峰面積。結果對照品峰面積為302 558，質量濃度為16.686 μg/mL；樣 品 峰 面 積 為297 245，含 量 為16.420 5 μg/mL。

圖2 橙皮苷測定高效液相色譜圖

圖3 姜黃素測定高效液相色譜圖

2.6 臣藥郁金中姜黃素含量測定

2.6.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠Diamosil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-1.5% 冰醋酸溶液（48 ∶52，V/ V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：360 nm。理論板數按橙皮苷峰計不低于4 000。在此色譜條件下，復方佛手口服液樣品中提取所得的橙皮苷保留時間大約為15 min。色譜圖見圖3。

2.6.2 溶液制備

稱取姜黃素對照品4.003 3 g，精密稱定，置10 mL清潔容量瓶中（質量濃度為398 μg/mL），加入甲醇適量使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備液；將其稀釋40 倍，即得每1 mL 含橙皮苷9.944 μg 的對照品溶液。量取濃縮藥液10 mL，置干凈清潔的蒸發皿中，于水浴鍋上濃縮至干，靜置冷卻至室溫，加入甲醇20 mL，超聲處理40 min，放冷至室溫，濾過，殘渣用10 mL 甲醇分別洗滌3 次，合并濾液，置水浴鍋上濃縮至2 mL，放冷，轉移至10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別按處方比例及制劑工藝制備不含郁金的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.6.3 方法學考察

陰性干擾試驗：比較陰性對照品溶液（不含郁金）、供試品溶液與姜黃素對照品溶液色譜圖，在姜黃素出峰時間處陰性樣品溶液無峰出現，分離較好，說明其他組分對橙皮苷含量測定無干擾（見圖3）。

線性關系考察：將對照品溶液（397.76 μg/mL）配成 質 量 濃 度 分 別 為99.44，79.552，39.776，19.888，9.944，4.972 μg/mL 的標準溶液，按擬訂色譜條件測定含量，以姜黃素含量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=60 558X-61 683，R2=0.999 6（n=6）。結果表明，姜黃素含量在0.049 72 ～0.099 44 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：分別精密吸取對照品溶液10 μL，連續進樣5 次。結果峰面積分別為598 693.3，665 138.3，598 609.1，593 094.1，634 847.8，RSD=4.58% （n=5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，精密量取10 μL，分別于0，2，4，8 h 時按擬訂色譜條件測定。結果的RSD=3.55%（n=4），表明供試品溶液在8 h 內穩定。

重復性試驗：取同一樣品，依法制備供試品溶液，平行4 份，測定含量。結果的RSD=3.14% （n=4），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱取處方量的藥材，平行6 份，依法制備供試品溶液（10 μg/mL），分別精密加入姜黃素對照品溶液（質量濃度分別約為15.4，15.4，16.6，16.6，16.7，16.7 μg/mL，依法測定其含量。結果平均回收率為85.35%，RSD為3.48%（n=6）。

2.6.4 樣品含量測定

方法同2.5.4 項，采用外標法。結果對照品峰面積為618 077，質量濃度為11.224 9 μg/mL，樣品峰面積為598 609.1，含量為10.903 5 μg/mL。

3 討論

3.1 提取工藝考察及優化

單因素試驗無法反映出多個因素之間相互作用的結果，可能對結果造成較大不良影響。因此，本研究中結合單因素考察結果，采用中心組合設計-響應面試驗法對提取次數、浸泡時間、提取時間、加水量幾個因素進行進一步考察，綜合分析結果確定提取工藝的最優條件并進行驗證。研究擬采用星點設計-響應面法優化提取工藝，因提取次數為非連續型變量，故按照單因素考察結果和試驗的實際情況，固定為提取3 次。以干膏得率、橙皮苷含量（μg/mL）為響應指標，進一步考察浸泡時間、提取時間、加水量因素對提取工藝的影響。最優提取條件確定，浸泡時間34 min，提取時間30 min，加水倍數9 倍。

3.2 澄清工藝改進

比較工藝Ⅰ水提醇沉法與工藝Ⅱ水提天然澄清劑澄清法對復方佛手口服液的澄清效果，工藝Ⅰ和工藝Ⅱ對中草藥有效成分有影響：乙醇沉淀工藝對生物堿、黃酮、苷類、有機酸、萜類、皂苷類能有效保留，但對氨基酸、多肽、多糖、蛋白質、鞣質均有沉淀作用，而ZTC1+1 澄清技術可保留更多有效成分如氨基酸、多肽、多糖。乙醇沉淀工藝和ZTC1+1 澄清技術得到的OD平均值分別為0.327 7 和0.390 2，可見ZTC1+1 澄清技術優于乙醇沉淀工藝。

3.3 鑒定及含量測定

復方佛手口服液中佛手為主藥，鑒定尤為重要，因此，除采用薄層色譜法鑒別外，還進行顯微鑒別作為補充。取本品細粉，用水合氯醛透化后，置顯微鏡下觀察，可檢出中果皮薄壁細胞、果皮表皮細胞及氣孔、草酸鈣方晶。進行含量測定時發現，姜黃素進行混煎后的口服液含量極其微量，并結合其水溶性低的物理特性，故將其單獨采用甲醇超聲提取后進行含量測定。本研究中延伸了院內制劑以前進行單體橙皮苷的測定，增加了臣藥姜黃素的含量測定。

3.4 展望

口服液是一種從湯劑、注射劑基礎上不斷發展，以合劑單劑量包裝而成的新劑型。口服液是對傳統湯劑進一步精制、濃縮、灌封、滅菌而得到的，結合了注射液的工藝優點，又去除了注射劑不良反應多的缺點。口服液因攜帶和服用方便、服用劑量較少、易保存、不良反應少等優點逐漸得到了患者的認可，具有良好的發展前景。復方佛手口服液經臨床檢驗，療效顯著，不良反應少，為中藥復方制劑治療抑郁癥提供了一種新的治療方案和選擇。