麻黃連翹赤小豆湯對α-萘異硫氰酸酯誘導大鼠膽汁淤積性肝損傷的防護作用

劉 翔，廖雪梅，張 蓓

（湖北省十堰市人民醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院感染科，湖北 十堰 442000）

肝內(nèi)膽汁淤積癥伴過量膽汁酸在全身和肝內(nèi)積聚，最終導致肝膽損傷[1]。若無適當治療，會導致黃疸、高膽固醇血癥及其他嚴重后果，如肝纖維化、肝硬化和肝功能衰竭[2-3]。熊去氧膽酸是美國食品藥物管理局（FDA）批準的唯一用于治療膽汁淤積的藥物，但不適用所有膽汁淤積患者[4-5]。麻黃連翹赤小豆湯源自《傷寒論》，是治療黃疸的傳統(tǒng)方法[6]。中醫(yī)學認為，該方為表里雙解劑，既可解表散邪，又可清熱除濕退黃，能有效減少炎性介質的表達，逆轉肝臟毒性，發(fā)揮抗炎保肝作用[7]。目前，關于麻黃連翹赤小豆湯對膽汁淤積性肝損傷的防護作用研究主要來自動物膽管結扎模型（肝外模型）的研究[8]。本研究中通過構建α-萘異硫氰酸酯（ANIT）誘導的大鼠膽汁淤積性肝損傷的模型，觀察麻黃連翹赤小豆湯對模型大鼠膽汁淤積性肝損傷的防護作用，檢測大鼠肝組織中核轉錄因子-kappaB（NF-κB）p65 及環(huán)氧合酶-2（COX-2）的蛋白和mRNA 表達情況?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物：成年雄性SD 大鼠50 只，8 周齡，體質量180 ～220 g，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK2011-0021，溫度（23±2）℃，相對濕度45% ～65%，光照/黑暗（12 h/12 h）循環(huán)，自由獲取食物和水。實驗方案經(jīng)湖北醫(yī)藥學院動物保護委員會批準，符合美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的實驗動物飼養(yǎng)和管理指南。

儀器：AU5800 型全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter 公司）；CLARIOstar Plus 型多功能酶標儀（美國BioTek 公司）；HHQ-2508 型病理冰凍切片機（深圳市匯沃科技有限公司）；9700 型PCR 擴增儀（美國Thermo公司）。

試藥：麻黃連翹赤小豆湯組方藥材均購自重慶市中醫(yī)院中藥房；ANIT（批號為N4525，規(guī)格為10 G，純度＞98%），兔抗大鼠NF-κBp65、COX-2 多克隆抗體（批號為BA0738，BC2121，規(guī)格為0.1 mL）均購自美國Sigma公司；天門冬酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、γ-谷 氨 酰 轉 移 酶（γ-GGT）、堿 性 磷 酸 酶（ALP）、總膽紅素（TBil）、直接膽紅素（DBil）檢測試劑盒，均購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司（批號分別為 2400317，2400122，2400124，2400157，2411725，2533105）；Trizol 試劑盒（美國Santa Cruz 公司，批號為KT86579，規(guī)格為1.25 mL）；逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR 試劑盒（美國Abcam 公司，批號為cx20061，規(guī)格為1.25 mL）；引物序列（美國Invitrogen 公司，批號為CD106，CD227，SC441，規(guī)格為100 μL）。

1.2 方法

1.2.1 分組與建模

取大鼠50 只，按體質量隨機分為正常對照組（A 組，等體積0.9%氯化鈉溶液），模型組（B 組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、麻黃連翹赤小豆湯低、中、高劑量（0.14，0.28，0.56 g/mL）組（C1組、C2組、C3組），各10 只，連續(xù)灌胃給藥（15 mL/kg）7 d，每天1 次，第5 天時，除A 組予橄欖油外，其余各組均予2%ANIT 橄欖油灌胃，以建立大鼠膽汁淤積肝損傷模型。

1.2.2 指標檢測

膽汁流量：大鼠處死前禁食12 h，然后以氨基甲酸乙酯（1 g/kg）腹膜內(nèi)麻醉，中腹部切口以插入膽總管，每隔15 min 收集1 次膽汁，共6 次，測量膽汁流量期間，用熱墊保持大鼠體溫，避免影響膽汁流量。膽汁流量=（EP1- EP2）×100 000/ ρ×m×15，其中EP1 和EP2 分別為收集膽汁后及收集膽汁前管質量，ρ 為膽汁密度，m為體質量。

肝臟系數(shù)：大鼠斷頭后快速取肝臟，稱定質量，計算肝臟系數(shù)。肝臟系數(shù)（%）=肝質量（g）/體質量（g）×100%。

肝臟組織病理切片：取自肝臟右大葉中央部分的樣品，以10%福爾馬林在磷酸鹽緩沖液中固定24 h，洗滌，脫水，包埋，切成約4 μm 厚的切片，用蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織結構和病變特點。

血清生化指標：ANIT 處理后48 h 收集下腔靜脈血，置室溫下4 ～8 h，在4 ℃條件下，2 000 r/min 離心10 min，回收血清，測定血清中AST，ALT，γ-GGT，ALP，TBil，DBil 含量。

NF-κBp65 mRNA 與COX-2 mRNA 表達：以Trizol試劑提取肝組織的總RNA（20 mg），用氯仿處理RNA，在4 ℃條件下，12 000 r/min 離心20 min，并以75%乙醇沉淀，將來自肝臟樣品的總RNA（1 μg）在20 μL的反應體積中進行逆轉錄，將合成的cDNA 保存在-20 ℃中。肝組織中NF-κBp65 的序列為，上游5′-CACGATCCTCGCCTGTTGTT -3′ ，下 游5′ -AAGGCCTTGCTGATCGTGGA-3′；COX-2 的序列為，上游5′-ACTCCCATAAGCCTGCTGAT-3′，下游5′-ATGCCCTTGGGTTGATCGTG-3′；β-actin 的序列為，上游5′-TGACCCAACTTGCAGCTCCA-3′，下游5′-TCATCCACATGAACTAGGTC-3′。擴增條件，95 ℃變性10 s，55 ℃復性10 s，然后72 ℃延伸15 s。β-actin 擴增條件，95 ℃變性1 min，57 ℃復性45 s，72 ℃延伸45 s。在每個循環(huán)結束時以逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測熒光信號強度。

NF-κB/COX-2 蛋白表達：將肝組織在含有1%苯甲基磺酰氟的RIPA 裂解液中勻漿后取上清液，以BCA 法檢測蛋白含量，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質，轉移到聚偏二氟乙烯膜上，并在4 ℃下與NF-κB/COX-2 一抗（1 ∶100）孵育過夜，洗滌后，將膜與二抗一起溫育2 h?；厥斩?，清洗3 次，加入化學發(fā)光劑，將膜放入暗盒，膠片顯影，清洗。將條帶灰度值數(shù)字化。以β-actin 為內(nèi)參計算相對光密度值（ROD）。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況

各組大鼠在灌胃給藥前5 d 精神狀態(tài)均良好。建模后，除A 組外，其余各組大鼠均有不同程度的飲食減少、精神萎靡、尿液呈黃褐色、眼睛輕度發(fā)紅等情況，其中以B 組尤為明顯。

2.2 膽汁流量

與A 組比較，B 組大鼠各個時間點的膽汁流量顯著減少（P ＜0.05）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組大鼠各個時間點的膽汁流量顯著增多（P ＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠給藥后不同時間膽汁流量比較[± s，μg/ （min·100 g），n=10]

表1 各組大鼠給藥后不同時間膽汁流量比較[± s，μg/ （min·100 g），n=10]

注：與A 組同時點比較，▲P ＜0.05；與B 組同時點比較，#P ＜0.05。下表同。

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組15 min 4.01±0.71 1.22±0.21▲2.17±0.45#2.09±0.25#2.11±0.61#30 min 3.87±0.79 1.15±0.50▲2.05±0.72#2.37±0.74#2.65±0.77#45 min 4.05±0.60 1.17±0.31▲2.13±0.66#1.87±0.68#1.92±0.41#60 min 3.92±0.87 1.13±0.67▲2.09±0.41#1.92±0.81#1.98±0.74#75 min 3.11±0.41 1.08±0.41▲1.93±0.25#1.89±0.33#1.87±0.61#90 min 2.98±0.55 0.95±0.33▲2.01±0.38#1.93±0.55#1.98±0.67#

2.3 肝臟組織病理

A 組大鼠肝組織細胞完整且飽滿，未見明顯損傷；B 組肝臟樣本發(fā)生壞死和退行性改變，并伴隨嚴重的小葉間膽管上皮細胞損傷和中性粒細胞浸潤；與B 組比較，C1組、C2組大鼠小葉間膽管僅有輕微上皮細胞損傷，較少的中型粒細胞浸潤和細微的退行性變異，而C3組的組織學圖像與A 組相似。詳見圖1。

2.4 肝功能及肝臟系數(shù)

與A 組比較，B 組大鼠肝功能指標及肝臟系數(shù)均顯著升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組大鼠肝功能指標均明顯降低（P ＜0.05），而與A 組比較，B 組大鼠肝臟系數(shù)顯著升高（P ＜0.05）；C1組、C2組、C3組大鼠的肝臟系數(shù)與B 組比較，無顯著差異（P ＞0.05）。詳見表2。

2.5 肝組織NF-κBp65 mRNA 及COX-2 mRNA的表達

與A 組比較，B 組大鼠肝組織NF-κBp65 mRNA及COX-2 mRNA 表達水平均顯著升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組大鼠肝組織NF-κBp65 mRNA 及COX-2 mRNA 表達水平均顯著降低（P ＜0.05）。詳見表3。

圖1 大鼠肝組織病理形態(tài)（HE，×100）

2.6 肝組織NF-κBp65 和COX-2 蛋白表達

與A 組比較，B 組大鼠肝組織NF-κBp65、COX-2蛋白表達水平均顯著升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組大鼠肝組織NF-κBp65、COX-2 蛋白表達水平均顯著降低（P ＜0.05）。詳見表3 和圖2。

表3 各組大鼠肝組織中NF-κBp65 和COX-2 mRNA 及蛋白表達水平比較（± s，n=10）

表3 各組大鼠肝組織中NF-κBp65 和COX-2 mRNA 及蛋白表達水平比較（± s，n=10）

組別mRNA 蛋白A 組B 組C1 組C2 組C3 組NF-κBp65 1.37±0.22 5.77±0.88▲3.15±0.34#2.91±0.41#2.74±0.22#COX-2 1.04±0.13 3.48±0.22▲2.14±0.29#1.92±0.23#1.65±0.18#NF-κBp65 0.044±0.011 0.275±0.067▲0.203±0.055#0.189±0.044#0.135±0.038#COX-2 0.051±0.009 0.258±0.048▲0.190±0.005#0.175±0.071#0.121±0.013#

圖2 各組肝組織中NF-κBp65 和COX-2 蛋白表達水平

表2 各組大鼠血清中肝功能及肝臟系數(shù)水平比較（± s，n=10）

表2 各組大鼠血清中肝功能及肝臟系數(shù)水平比較（± s，n=10）

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組ALT（U/L）51.22±9.25 226.17±18.24▲175.45±14.27#128.73±15.49#74.88±11.07#AST（U/L）118.47±16.71 488.60±101.26▲407.33±65.22#346.96±71.65#267.91±55.63#ALP（U/L）381.27±45.57 511.67±66.41▲461.28±51.72#449.17±41.28#423.32±49.47#γ-GGT（U/L）4.12±0.58 25.41±2.57▲17.55±2.14#15.24±1.52#11.38±0.73#TBil（μmol /L）2.77±0.21 25.81±3.31▲14.63±1.25#13.87±1.18#12.88±1.32#DBil（μmol /L）0.21±0.02 37.21±4.15▲25.14±6.15#23.45±4.65#21.87±6.21#肝臟系數(shù)4.32±0.15 4.66±0.21▲4.51±0.14 4.53±0.17 4.57±0.23

3 討論

ANIT 是常用模型藥物，可破壞膽管上皮細胞，導致膽汁引流阻塞，從而形成肝內(nèi)膽汁淤積的病理模型；肝內(nèi)膽汁淤積是導致膽汁流量受損的主要原因，并最終導致肝硬化[9]。迄今，肝內(nèi)膽汁淤積尚無有效的治療方法，雖然熊去氧膽酸使用較多，但仍有1/3 的患者并不合適[10]。最近發(fā)現(xiàn)，一些中藥對肝內(nèi)膽汁淤積和肝損傷有一定的保肝作用。如麻黃連翹赤小豆湯，方中連翹具有抗菌作用；丹參是氧自由基的強力清除劑，具有抗炎抗菌作用；麻黃宣肺利水消腫。近代名醫(yī)冉雪峰曾評此方甘涼清潤、和中安中，適用于濕熱郁遏、表衛(wèi)之證。膽汁流量是反映肝內(nèi)膽汁淤積程度的關鍵指標。本研究中，B 組大鼠膽汁流量明顯減少，證實了ANIT 能造成大鼠肝內(nèi)膽汁淤積，C1組、C2組、C3組大鼠膽汁流量均得到改善，表明麻黃連翹赤小豆湯有緩解肝內(nèi)膽汁淤積的作用。

血清肝功能指標中，ALT 和AST 為肝細胞損傷的指標，ALP 和γ-GGT 是膽汁淤積、肝臟毒性感染的敏感生物標志物，TBil 和DBil 是肝臟代謝功能最直接的指標[11]。本研究結果顯示，ANIT 引起大鼠血清中AST、ALT、γ-GGT、ALP、TBil、DBil 水平顯著升高，這些血清學結果的變化伴隨著肝臟組織病理變化，包括小葉間膽管上皮細胞損傷和中性粒細胞浸潤。同時，C1組，C2組和C3組與B 組比較，血清學指標顯著降低，肝臟組織病理形態(tài)學顯著改善，提示麻黃連翹赤小豆湯能減輕肝細胞損傷，改善膽汁淤積和肝功能代謝水平。可見，麻黃連翹赤小豆湯可抑制ANIT 誘導的大鼠膽汁淤積性肝損傷的發(fā)展。

NF-κB 主要存在于真核細胞，是參與免疫和炎性反應的關鍵調(diào)節(jié)因子，且有研究提示，其中具有顯著促炎活性的是含p65 的二聚體[12-13]。NF-κB 信號通路活化在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到十分關鍵的作用，尤其是在炎性反應和免疫反應中。COX-2 是NF-κB 途徑的下游分子之一，NF-κB 的活化導致炎性因子增加，如正常情況下，COX-2 在組織中不表達[14]。COX-2 通過促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進血管生成，抑制免疫功能等機制，參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展[15]。炎性介質的釋放加速了ANIT 誘導的膽汁淤積肝損傷，但確切機制尚不清楚[16]。本研究中，NF-κB 及COX-2 的蛋白和mRNA 在ANIT 誘導的膽汁淤積性肝損傷模型大鼠的肝組織中表達水平上調(diào)，提示二者的過表達可能促進急性肝損傷和膽汁淤積的發(fā)展，表明NF-κB/COX-2 通路在膽汁淤積性肝損傷的發(fā)展中發(fā)揮了十分關鍵的作用。在膽汁淤積性肝損傷出現(xiàn)后，對ANIT處理的大鼠用麻黃連翹赤小豆湯進行灌胃，結果顯示，麻黃連翹赤小豆湯能顯著降低NF-κB、COX-2 的蛋白和mRNA 表達水平，且呈劑量依賴性。這些結果表明，麻黃連翹赤小豆湯能阻斷NF-κB/COX-2 通路，從而對ANIT 誘導的大鼠急性肝損傷和膽汁淤積起到治療作用，但其治療作用可能并不是完全依賴此信號通路。

綜上所述，麻黃連翹赤小豆湯能顯著增加膽汁淤積性肝損傷模型大鼠的膽汁流量，改善肝臟組織病理，降低血清中AST、ALT、γ-GGT、ALP、TBil、DBil 水平，降低肝組織中NF-κBp65 及COX-2 的蛋白和mRNA 表達水平。本研究結果為麻黃連翹赤小豆湯臨床用于膽汁淤積性肝損傷治療的進一步開發(fā)和利用提供了重要的實驗依據(jù)，其作用的分子機制可能與抑制NF-κB/COX-2 通路有關，對于擴寬中藥復方干預膽汁淤積性肝損傷有一定意義，但尚需進一步研究予以證實。