正交試驗優(yōu)選木姜葉柯中三葉苷提取工藝

王李婷，王向根，李 星，江仁峰，肖順麗

（湖南醫(yī)藥學院藥學院，湖南 懷化 418000）

木姜葉柯又名多穗石柯、甜茶，為殼斗科柯屬植物木姜葉柯Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun 的干燥嫩葉[1]。其為我國特有的植物資源，兼有茶、糖、藥的功能，在民間應用已有上千年歷史，具有清熱解毒、化痰、祛風、降壓作用，主要用于治療濕熱痢疾、皮膚瘙癢、癰疽惡瘡等病癥[2]。現代藥理研究表明，木姜葉柯中的黃酮成分具有降血糖[3-4]、抗過敏[5]、抗氧化[6-7]、改善記憶力[8]等藥理作用。三葉苷是木姜葉柯中黃酮類含量最高的成分，對于預防肥胖、糖尿病、心血管病和高血壓有一定效果[9]，具有抑制糖尿病[9-10]、抗氧化[11]、促肝細胞增殖[12]等作用。本研究中以三葉苷含量為評價指標，采用正交試驗法優(yōu)選提取過程中液料比、提取時間、提取次數，為三葉苷的開發(fā)、利用奠定基礎。現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀，包括G1311B 四元泵和G4212B 型二極管陣列檢測器（美國Agilent 公司）；AUW120D 型電子分析天平（日本Shimadzu 公司）；Mighty-10 型超純水機（上海礫鼎水處理設備有限公司）；RE-52CS 型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

三葉苷對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號為WKQ18052505，含量＞98.0%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。木姜葉柯藥材樣品購自君健中藥材合作社，經湖南醫(yī)藥學院蔡偉博士鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 三葉苷含量測定

2.1.1 色譜條件[13-15]

色譜柱：Agilent XDB -C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.5%磷酸水溶液（50 ∶50，V/ V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在此條件下的色譜圖見圖1。

2.1.2 溶液制備

取三葉苷對照品適量，精密稱定，加水制得對照品溶液。精密移取木姜葉柯提取液適量，以水定容至1 000 mL，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密量取對照品溶液0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，置10 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，制成系列對照品溶液，取10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以三葉苷質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=25 683X+17.308（r=0.999 9）。結果表明，三葉苷質量濃度在0.012 3 ～0.246 0 mg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗：試驗按相關規(guī)定進行，結果儀器精密度良好，供試品溶液室溫放置12 h 內基本穩(wěn)定，方法重復性良好。

2.2 正交試驗

以液料比（因素A）、提取時間（因素B）、提取次數（因素C）為三因素，三葉苷含量為評價指標，采用L9（34）正交表進行試驗，因素水平見表1，數據采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件分析。

表1 因素水平表

正交試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。可見，以三葉苷含量為指標，木姜葉柯正交試驗中考察因素的影響強度依次為C ＞B ＞A，且差異均有顯著性（P＜0.05）。A 因素中，A3＞A2＞A1，故選擇A3；B 因素中B2＞B1＞B3，故選B2；C 因素中，C3＞C2＞C1，故選C3。由此可推出，A3B2C3為最優(yōu)方案，即液料比15 ∶1，提取3 次，每次1.5 h。

2.3 工藝驗證

稱取木姜葉柯3 份，每份10 g，按最佳工藝條件提取，測得三葉苷的含量分別為33.45% ，34.16% ，34.05%，平均33.89%，RSD為1.14%。

3 討論

表2 L9（34）正交試驗設計及結果

表3 方差分析結果

現有文獻中關于木姜葉柯提取工藝大多為開發(fā)茶飲料進行的提取工藝考察，以多成分為指標，結果為液料比大，提取時間短，但三葉苷的提取率較低[13-14]。

本研究中參考文獻[15-16]，以水為提取溶劑，以液料比、提取時間和提取次數為三因素。為節(jié)約生產成本和便于實際工業(yè)生產，液料比選擇9 ∶1，12 ∶1，15 ∶1。預試驗中發(fā)現，三葉苷的含量隨著提取時間的延長而逐漸增加，故提取時間選擇1.0，1.5，2.0 h。

本研究結果表明，各因素對提取效果影響強度依次為提取次數＞提取時間＞液料比；篩選出最佳提取方案為A3B2C3，即稱取適量木姜葉柯，加入15 倍水，提取3次，每次1.5 h。在此工藝下三葉苷的平均含量為33.89% ，說明該提取工藝穩(wěn)定，提取率高，可為大規(guī)模生產提供參考。