番茄紅素防護腎臟缺血再灌注損傷及其對自噬機制的影響*

曾 敬，楊小利，劉漁凱，謝紅英

（中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學附屬大坪醫(yī)院心血管內(nèi)科·重慶市心血管病研究所，重慶 400042）

腎臟缺血再灌注損傷（RIRI）是臨床常見病理現(xiàn)象，腎移植、腎臟及其血管外科手術(shù)、體外沖擊波碎石等均有可能引起RIRI[1]。腎臟缺血再灌注會引起細胞凋亡和壞死，由此引起急性腎小管壞死，從而損傷腎臟功能，還可能影響腎臟功能的恢復，使疾病死亡率升高[2]。番茄紅素（lycopene）是植物中的一種天然色素，主要存在于茄科植物西紅柿的成熟果實中，具有強大的抗氧化作用[3]和促進細胞自噬的作用[4]。既往研究證實，番茄紅素具有防護細胞及組織缺血再灌注損傷的作用[5-6]，但主要集中在心、腦等器官，對番茄紅素在腎臟缺血再灌注損傷中的作用及其具體機制的研究相對較少。自噬作為實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和更新的重要途徑，是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機制，在調(diào)節(jié)缺血再灌注損傷中起到了重要作用[7]。其中LC3 Ⅱ是自噬的特異性蛋白，在自噬的調(diào)節(jié)機制中有關(guān)鍵性作用[8]。本研究中通過大鼠腎臟缺血再灌注模型，觀察番茄紅素對腎臟缺血再灌注后腎臟組織的影響，同時利用自噬抑制劑3-MA 來明確番茄紅素是否通過激活自噬途徑來減輕腎臟缺血再灌注損傷。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：選用健康雄性SD 大鼠（SPF 級）20 只，周齡8 ～9 周，體質(zhì)量200 ～250 g，由陸軍軍醫(yī)大學附屬大坪醫(yī)院動物中心提供（動物許可證編號為SCXK ＜渝＞2017-0006）。大鼠均給予常規(guī)喂養(yǎng)。符合陸軍軍醫(yī)大學實驗動物倫理委員會的倫理審查要求。

試藥：番茄紅素（Sigma Aldrich，批號75051）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、ATP 酶活性等均通過檢測試劑盒檢測，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；其余試劑及有機溶劑均為分析純（Sigma Aldrich）。

1.2 模型建立及動物分組

所有大鼠給予腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，腹正中切口，切除右側(cè)腎臟，游離左側(cè)腎臟，備用。將大鼠隨機分為4 組：1）假手術(shù)組（A 組），術(shù)前30 min腹腔一次性注射等體積的0.9%氯化鈉注射液，全身麻醉后完成前文描述的手術(shù)部分后，與其他組動物放置相同的時間。2）缺血再灌注組（B 組），術(shù)前30 min 腹腔一次性注射等體積的0.9%氯化鈉注射液，用血管夾夾閉左側(cè)腎蒂缺血1 h，打開血管夾再灌注1 h。3）番茄紅素+缺血再灌注組（C 組），術(shù)前30 min 腹腔一次性注射番茄紅素（20 mg/kg），用血管夾夾閉左側(cè)腎蒂缺血1 h，打開血管夾再灌注1 h。4）番茄紅素+3 -MA +缺血再灌注組（D 組），術(shù)前30 min 腹腔一次性注射番茄紅素（20 mg/kg）+3-MA（20 mg/kg），用血管夾夾閉左側(cè)腎蒂缺血1 h，打開血管夾再灌注1 h。結(jié)束后，取上述4 組大鼠左側(cè)腎臟，去除包膜，洗凈腎內(nèi)殘余血液，拭干，稱取0.5 g 制成組織勻漿，用不同試劑盒測定各組MDA含量、SOD 活性、Na+，K+ -ATP 酶和Ca2+/ATP 酶活性，并通過比較B 組與A 組大鼠的病理、生化改變，確定模型建立是否成功。

1.3 檢測指標

腎臟病理：實驗腎臟組織經(jīng)10%福爾馬林固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片，按HE 染色流程染色，顯微鏡下觀察病理結(jié)構(gòu)變化。

腎臟LC3 ⅡWestern Blot：取實驗腎臟組織，液氮研磨后加含有1 μmol/L 的RIPA 裂解液（碧云天，P0013B）裂解提取蛋白，SDS-PAGE 電泳跑膠后半干轉(zhuǎn)至NC 膜，1 ∶1 000 比例稀釋LC3 抗體（Sigma Aldrich，L8918）和GAPDH（Sigma Aldrich，G9545）并孵育過夜，HRP 二抗孵育并常規(guī)顯色，使用Odyssey 掃膜儀掃描條帶后統(tǒng)計LC3 Ⅱ與GAPDH 的比值并計算。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用ANOVA單因素方差分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對各指標的影響

結(jié)果見表1。可見，與A 組相比，B 組大鼠MDA 含量明顯增高，SOD 活性明顯下降。與B 組相比，C 組大鼠MDA 含量明顯降低，SOD 活性明顯升高；D 組大鼠番茄紅素對腎臟缺血再灌注后MDA 和SOD 的作用明顯減弱。與A 組比較，B 組大鼠的Na+，K+-ATP 酶、Ca2+/ATP 酶活性顯著下降（P ＜0.01），提示腎臟組織在缺血再灌注過程中發(fā)生脂質(zhì)過氧化，Na+，K+-ATP 酶、Ca2+/ATP 酶活性受到抑制；經(jīng)番茄紅素處理后，Na+，K+-ATP 酶、Ca2+/ATP 酶活性顯著增強（P ＜0.05），表明番茄紅素能減輕腎組織的脂質(zhì)過氧化損傷，保護腎臟功能。D 組的ATP 酶活性下降，表明上述保護作用可被3-MA 抑制。

表1 番茄紅素對腎臟缺血再灌注大鼠腎臟組織中各指標的影響（± s，n=5）

表1 番茄紅素對腎臟缺血再灌注大鼠腎臟組織中各指標的影響（± s，n=5）

注：與A 組相比，*P ＜0.05；與B 組相比，#P ＜0.05；與C 組相比，&P ＜0.05。圖2 同。

組別A 組B 組C 組D 組MDA（nmol/g）27±5 48±12*37±9#44±7&SOD（U/g）118±21 77±16*115±31#88±13&Na+，K+ -ATP 酶（μmolPi/mg·Pr·h）4.5±1.2 2.3±0.6*3.5±1.3#2.7±0.5&Ca2 + /ATP 酶（μmolPi/ mg·Pr·h）5.8±1.5 3.1±1.7*4.6±1.4#3.5±1.1&

2.2 減輕腎臟缺血再灌注損傷

腎臟缺血再灌注后HE 染色切片顯示，缺血再灌注引起腎小管上皮細胞腫脹，而番茄紅素能明顯減輕缺血再灌注引起的腎小管上皮細胞腫脹；但在D 組中，番茄紅素保護作用明顯減弱，提示番茄紅素的保護機制有可能是通過調(diào)控細胞的自噬活動。見圖1。

圖1 腎臟缺血再灌注后各組腎臟組織切片HE 染色（×400）

2.3 增加腎臟自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ表達

LC3 Ⅱ的形成是自噬增強的一個指標，通過對各組大鼠腎臟LC3 Ⅱ表達量的檢測，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注引起腎臟LC3 Ⅱ表達升高，番茄紅素可進一步增加腎臟缺血再灌注時LC3 Ⅱ的表達，但3-MA 可阻斷番茄紅素對LC3 Ⅱ表達的上調(diào)作用，提示番茄紅素可能通過激活腎臟自噬而改善缺血再灌注損傷。見圖2。

圖2 腎臟缺血再灌注后各組腎臟組織LC3 Ⅱ蛋白水平

3 討論

持續(xù)性的腎臟缺血將造成不可逆的損傷，盡快恢復腎臟的血供是治療腎臟缺血的前提，但再灌注的同時也可能帶來進一步的腎臟再灌注損傷[9]。氧化應激和自噬都是組織細胞在缺血再灌注過程中都存在的病理生理現(xiàn)象。缺血再灌注導致的組織細胞損傷主要與自由基、鈣超載、白細胞增加、高能磷酸化物缺乏等密切相關(guān)[10]。而自噬一般被認為是細胞在氧化應激及營養(yǎng)匱乏等條件下的一種自我保護機制。通常情況下，自噬維持在較低水平，但ATP 能量耗竭、活性氧的釋放、線粒體膜通道的開放都會導致自噬活性迅速升高，故在缺血再灌注過程中的自噬活性增強。

在腎臟缺血再灌注損傷過程中，由于組織缺血缺氧，ATP 生成減少，膜泵失效，細胞內(nèi)Ca2+增加，激活Ca2+依賴性蛋白酶，使黃嘌呤脫氫酶大量轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，而黃嘌呤氧化酶催化產(chǎn)生大量的活性氧自由基可損傷組織[11]。MDA 是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，能加劇細胞膜的損傷，因此通過MDA 了解膜脂過氧化的程度，可間接測定膜系統(tǒng)的受損程度，升高提示組織或細胞損傷明顯[12]。SOD 是組織自身存在的一種抗氧化金屬酶，能催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化平衡中可起到至關(guān)重要的作用[13]。腎小管基底膜內(nèi)側(cè)膜有Na+，K+-ATP 酶，主要起到排Na+保K+的作用，是維持細胞內(nèi)Na+和K+濃度穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)酶，在缺血再灌注損傷時，其調(diào)節(jié)功能受到損傷[14]。同樣，在缺血再灌注損傷發(fā)生時，還可造成Ca2+-ATP 酶受損，這也是引起細胞內(nèi)Ca2+超載的原因之一[15]。既往研究表明，番茄紅素對心、腦缺血再灌注損傷具有保護作用[16]，其保護機制除了抗氧化作用外，還有激活細胞內(nèi)自噬活動的作用[4]，而對腎臟缺血再灌注過程中自噬的影響尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，腎臟缺血再灌注后腎臟組織的MDA 含量明顯增高，SOD 活性明顯下降，其酶活性也明顯下降，證實了缺血再灌注對腎臟造成了損傷，確定了建模的成功。在給予番茄紅素處理后，其MDA 含量明顯降低，SOD 活性明顯升高，酶活性同樣得到一定程度的恢復，說明了番茄紅素對腎臟缺血再灌注損傷具有保護作用。同時，HE 染色結(jié)果也支持上述結(jié)論。在對番茄紅素與自噬相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)，通過檢測LC3 Ⅱ表達量的變化，應用番茄紅素處理后大鼠腎臟LC3 Ⅱ表達明顯升高，使用自噬抑制劑3-MA 可明顯減弱番茄紅素對LC3 Ⅱ表達升高的作用。同時，使用3-MA 后，由生化學和酶學的研究結(jié)果可見，番茄紅素對腎臟缺血再灌注損傷的保護作用被抑制，提示番茄紅素可能是通過自噬減輕了腎臟的缺血再灌注損傷程度。

綜上所述，番茄紅素在腎臟缺血再灌注損傷中具有保護作用，其機制可能是通過激活自噬來減輕腎臟缺血再灌注損傷。