細菌III型分泌系統及其效應蛋白致病性研究進展

陸彭磊，蔡少平

近年來，人們發現，細菌為了適應宿主體內的生存環境，更好地在宿主體內生長繁殖，通常需要分泌一些毒力因子或毒力相關性蛋白以創造適宜自身生存的環境。細菌因此進化出許多不同的分泌系統以分泌毒力因子或毒力相關性蛋白[1]。細菌III型分泌系統(Type III secretion system，T3SS)是其中之一。在分泌系統中，與病原體存活及毒力相關的蛋白質稱為效應蛋白(effector protein)。細胞凋亡和細胞焦亡(Pryoptosis)是宿主細胞清除致病菌、維持機體穩態的兩種主要途徑，也是部分革蘭陰性菌的 T3SS 效應蛋白操縱宿主細胞死亡的兩個主要方面[2]，但是不同的效應蛋白在該過程中發揮的功能不同。隨著研究的不斷拓展和深入，現今發現T3SS在致病過程不僅具有復雜的分子裝置，也是蛋白質的一種運輸工具，同時還能反向抑制信號通路，從而調控信號的傳遞強度。本文就針對T3SS效應蛋白分泌機制進行綜述。

1 細菌分泌系統概述

革蘭陰性菌有許多分泌蛋白和外露蛋白，但在發育和進化過程中是通過相對較少的分泌機制分泌蛋白的。目前認為的革蘭陰性菌分泌系統有9個，I～IX型[3]。其中T3SS是一個多組分蛋白形成的復合體跨膜通道。目前對副溶血弧菌[4]、銅綠假單胞菌[5]等革蘭陰性菌的T3SS效應蛋白致病機理和鑒定方法的研究比較廣泛。遺傳和分子學分析表明T3SS組裝和分泌的效應物在蛋白質分泌的過程中起到關鍵調節的作用。同時作為必需的毒力因子，T3SS是疫苗和治療的有效靶標[6]。T3SS其結構部件由20多種不同的蛋白質組成，形成基部、細胞外針、尖端復合體和一個易位蛋白[7-8]。Nans A通過用低溫電子斷層掃描和亞層斷層掃描獲得沙眼衣原體T3SS的超微完整結構，證實T3SS通過形成類似于泵樣的構象變化來與宿主產生聯系[9]。由此可見，部分革蘭陰性菌在與宿主接觸中存在一種跨膜通道用于傳輸效應物，該跨膜通道的作用和傳輸方式需進一步通過其與細菌致病的機制結合研究。

2 T3SS分泌系統在細菌致病過程中作用

細菌III型分泌系統是許多革蘭陰性致病菌中存在的復雜的分子裝置，T3SS通過分泌蛋白將毒力蛋白直接注入宿主細胞以達到致病目的。首先從結構上，T3SS的核心結構包括固定在細菌膜表面的基本結構，這一基本結構由3種蛋白質齊聚成環組成。其中蛋白質SctD和SctJ形成環狀組成空心內壁(Inner membrane，IM)，蛋白質SctC形成獨立外部環狀外壁(Outer membrane，OM)。IM和OM組合形成整個T3SS結構，其中SctD、SctJ和SctC的結構的完整性對于T3SS的活性起到至關重要的作用[10]。同時，Halder, PK研究中將PscN定義為T3SS的ATP酶，將PscL定義為其未表征的調節因子，并指出PscL和PSCN在1∶2的比例下ATP酶活性即可達到80%。因此PscL不僅是PSCN的調節器，并且可以形成三維模型相互作用[11]。所以，T3SS的結構模型完整性在致病過程中起關鍵作用，同時其中的調節因子也可以調節致病菌注入宿主細胞的程度。可見，T3SS結構完整性使得T3SS可以通過激活酶類活性或特異性抑制酶類活性來達到調控毒力蛋白注入宿主細胞的目的。

與此同時，T3SS作為一種運輸工具，通常是通過其跨膜通道的特性，來完成其致病的目的。Cameron EA研究顯示，腸道中擬桿菌屬T3SS會自身水解從而反向抑制疾病進程，同時通過與腸出血性大腸埃希菌形成一種共生病原體的關系，提供給腸出血性大腸埃希菌適合定植的微環境，幫助腸出血性大腸埃希菌自身內源性蛋白酶在哺乳動物細胞中形成T3SS孔，促進T3SS將毒力因子易位到宿主細胞內，從而引起腸道疾病[12]。Kim SI研究顯示沙門菌致病因子編碼的細菌III型分泌系統效應蛋白，通過外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMV一種革蘭陰性菌釋放的球形膜狀結構)分泌。鼠傷寒沙門菌可以利用OMV作為運輸工具將這種效應蛋白遞送到宿主細胞的細胞質中，而不依賴于細菌與宿主細胞的相互作用[13]。

另外，T3SS上基因簇編碼和對非致病因子編碼的調控也反映出與細菌毒性上的相關作用。張秀彩研究顯示當菌株轉錄調控因子表達水平較高時，效應蛋白編碼基因表達水平相對偏低，存在負相關性[14]。Kassa EG通過流式細胞儀的檢測和成像技術跟蹤感染細胞效應物的動力學和膜運輸。發現腸致病性大腸埃希菌效應物控制上皮宿主細胞的內吞和轉胞吞。影響了機體內循環機制，使宿主質膜蛋白發生錯誤定位和富集，這些現象被證實與細菌定植和毒性存在一定的聯系[15]。

同時，T3SS可以通過去磷酸化或去乙酰化來促進病原菌的生長。Desveaux研究發現T3SS通過將丁香假單胞菌乙酰轉移酶遞送到宿主細胞中以促進細菌生長。丁香假單胞菌乙酰轉移酶的生物學活性能導致宿主細胞觸發其免疫應答。研究結果表明丁香假單胞菌乙酰轉移酶可以乙酰化受體細胞質激酶，并通過激酶結構構象改變來促進細菌生長[16]。Dortet L研究顯示病原菌在感染早期就已經出現了誘導T3SS去磷酸化和去乙酰化。細菌病原體可以通過影響表位遺傳因子來重新編碼靶細胞。由易位蛋白操縱組蛋白，形成孔狀毒素分泌到細胞外環境中，繼而引發病原菌破壞宿主細胞[17]。其次，T3SS中結構部件易位蛋白在轉運中也起到了關鍵作用。George Z研究發現沙眼衣原體可以利用T3SS中的易位蛋白(肌動蛋白招募磷蛋白 the Translocated Actin-Recruiting Phosphoprotein，TRAP)刺激宿主細胞的細胞骨架重組以達到入侵和進行性發展的目的。同時肌球蛋白輕鏈激酶、TARP低聚和肌球蛋白ATP酶的特異性抑制能顯著降低未折疊蛋白應答反應的激活和衣原體的復制[18]。Romano Fabian B研究發現銅綠假單胞菌中的易位蛋白PopB和PopD。PopD在膜中形成六聚體結構，通過與PopB的相互作用，形成一種獨特的由8個PopB和8個PopD分子組成的異源寡聚體組裝結構蛋白模型[19]。Armentrout E I也從遺傳的角度識別到蛋白與蛋白之間接觸由易位蛋白形成跨膜通道來完成，其中PopD是必須存在的并且積極參與到易位孔構象改變的易位蛋白[20]。

3 T3SS分泌系統反向抑制作用

細菌分泌系統不僅可以通過調控其通道的輸送功能完成其毒力作用，研究發現缺失部分毒力相關致病因子也會影響感染發病。趙凱英研究顯示T3SS有助于致病菌在組織中大量增殖，其中如果遲緩愛德華菌缺失eseC基因，可影響效應蛋白分泌到宿主細胞內發揮效應，影響了遲緩愛德華菌的致炎作用[21]。另有研究發現在T3SS中，沙門菌致病因子可以阻止主要組織相容性II類復合物通過沙門菌感染抗原提呈給宿主細胞[22]。原因之一是缺失編碼分子伴侶對致病產生了直接影響，另外磷脂酰膽堿缺失也影響膜蛋白在細胞膜內的轉運和組裝，最終導致組裝后的T3SS裝置不能正常發揮T3SS的跨膜轉運功能[23]。

其次，在T3SS跨膜轉運中將轉運蛋白的組裝進行一定的構象改變，也會對蛋白轉運過程形成一定的影響。Tang Y研究發現銅綠假單胞菌中的轉運蛋白在膜中組裝成二聚體，形成特殊構象后，可將編碼N`末端區域暴露于宿主細胞中，利于功能性蛋白與宿主接觸[24]。Belyy A研究發現銅綠假單胞菌分離株含有ExoY變體，其突變改變了該效應子的C`末端。這些天然存在的ExoY變體表現出顯著降低的酶活性和毒性的作用[25]。因此可以看出T3SS缺失部分關鍵性編碼分子、關鍵酶類或形成構象改變可以影響其毒力的輸送功能。

4 T3SS分泌系統的競爭和協同作用

外膜蛋白在T3SS系統中也起到了一些間接作用。Chowdhury R研究顯示外膜蛋白協同T3SS使小鼠傷寒菌致病，外膜蛋白可以粘附在T3SS的粘連蛋白層來達到間接入侵宿主的目的[26]。同時細胞中的外膜蛋白通過其自身的20個氨基酸與酪氨酸激酶相互作用，抑制酪氨酸激酶活性以限制體內傷寒沙門菌的腸道入侵和全身感染[27]。可見外膜蛋白可以通過T3SS對細菌的致病起到間接的影響。

5 T3SS分泌系統的人為干預和相關藥物應用

現階段的研究顯示靶向抑制劑可以通過關閉3型分泌蛋白分泌的高度抗原性蛋白質來清除和關閉志賀氏菌的免疫記憶的呈現，這項研究也給用非菌藥物療法對抗T3SS的ATP酶提供了可能性[28]。也有研究顯示5種植物的乙醇提取物(三葉雞矢藤、布奇漢姆屬、楊梅竹柏藤、欖仁黃花菜、百里香屬和甜樟屬)對T3SS中的蛋白質有抑制鼠傷寒沙門菌活性的作用，同時顯示夏枯草對金黃色葡萄球菌有很強的抗菌活性可能也與T3SS系統有關[29]。可見藥物對T3SS也有關閉T3SS蛋白分泌通道和消除免疫記憶的呈現來抑制細菌活性的作用。

6 總結與展望

綜上，T3SS與細菌運輸毒力因子或毒力相關性蛋白息息相關。T3SS通過形成復雜的分子裝置作為運輸工具。同時通過去磷酸化或去乙酰化促進病原菌的生長，通過分子裝置結構構象改變影響細菌的毒力作用。T3SS組裝件之一易位蛋白也對轉運起到了關鍵作用，同時基因表達的缺失也能一定程度影響T3SS的轉運。其次，藥物應用上有部分藥物甚至像夏枯草等中藥在抗菌活性上也可能與T3SS有關。在實際應用中，有文獻顯示腸出血性大腸埃希菌和腸致病性大腸埃希菌T3SS分泌的EspY3(一種新的非致病因子編碼的腸出血性大腸埃希菌T3SS效應物)與沙門菌的效應蛋白具有同源性[30]。還可以使用基因組的生物信息學預測工具來分類檢索革蘭陰性菌中T3SS的基因，以增大細菌致病基因的檢出率[31-32]。對T3SS分泌系統的藥物干預為臨床通過非抗菌藥物療法或研究新型抗菌藥物提供了理論依據，同時用基因組學的檢索工具來分類T3SS基因組的生物學信息也進一步加大了細菌致病基因的檢出效率。

T3SS在細菌胞質分泌過程中起到了起承轉合的作用，對于了解細菌毒性和預測臨床預后具有重要的意義。T3SS作為分泌蛋白，具有分泌蛋白性質毒力因子的能力，是革蘭陰性菌相對較少的幾種分泌機制之一，也是革蘭陰性菌為了適應其在宿主細胞內生存環境，而向外分泌的具有重要功能的蛋白。細菌分泌系統在近年來細菌致病機制研究中進展迅速，并且成為新的耐藥性研究熱點。希望本文能為制定和研究T3SS在宿主細胞中的作用機制提供參考依據。

利益沖突：無