死亡結構域蛋白Daxx與DNA病毒蛋白相互作用及影響的研究進展

丁 霜，唐雙陽，楊曉東，申海艷，萬艷平

死亡結構域蛋白(Death domain-associated protein，Daxx)[1]是一種多功能蛋白，可與胞內蛋白或病毒蛋白相互作用，從而參與細胞凋亡、轉錄調控、抗病毒感染等。正常情況下，Daxx是早幼粒細胞白血病蛋白核體(PML nuclear bodies，PML NBs)的恒定駐留蛋白，它常與早幼粒細胞白血病蛋白(Promyelocytic leukemia，PML)、轉錄抑制因子Sp100及其它蛋白構成PML NBs的球形結構并維持其穩定性[2-3]。但當DNA病毒在核表達后，DNA病毒能以PML NBs為靶點使其被拆解并重組，導致Daxx不能正常定位于PML NBs而有利于病毒基因的轉錄調控、復制并支持感染的建立[2]。不僅如此，某些DNA病毒還可表達相應蛋白與Daxx相互作用，對病毒基因的表達產生影響。近年來國內外研究人員對人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)、人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)和人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)等DNA病毒及其表達蛋白之間的作用做了較多研究和探索，本文主要綜述近年來Daxx與不同DNA病毒蛋白相互作用及影響的研究進展。

1 Daxx與人腺病毒蛋白

HAdV早期1B區55-kDa蛋白(Early region 1B 55-kDa protein，E1B-55k)是一種多功能磷酸化蛋白，它能降解宿主細胞蛋白、輸出病毒晚期mRNA、抑制p53介導的轉錄等，在腺病毒感染過程中起關鍵作用[4]。在E1B-55k蛋白早期表達時，它能以依賴小泛素樣修飾(small Ubiquitin-like modifier，SUMO)的方式抑制染色質重塑因子Daxx[5]。其中，Daxx可抑制高效HAdV的感染，但這種抗病毒反應可被HAdV E1B-55k蛋白經多種途徑中和[6]。當Daxx與α地中海貧血/X連鎖智力低下綜合癥蛋白(X-linked α-thalassemia/mental retardation syndrome，ATRX)染色質重塑復合物抑制HAdV復制時，E1B-55k蛋白可與早期4區開放閱讀框蛋白6(Early region 4 open reading frame protein 6，E4 ORF6)組裝成E3泛素連接酶樣復合物，協同抑制Daxx，并啟動蛋白酶體拮抗ATRX，從而促進病毒基因表達[7]。近年也有研究表明，E1B-55k蛋白可與宿主蛋白酶體形成新的降解途徑降解Daxx。該降解途徑主要通過E1B-55k招募指環蛋白4(RING-finger protein 4，RNF4)并形成復合物抑制Daxx的功能，且該途徑獨立于經典的HAdV E3泛素連接酶復合物[6]。其中，RNF4屬于SUMO靶向泛素連接酶(SUMO-targeted Ubiquitin ligases，STUbL)蛋白家族成員[8]，一方面，它能促進E1B-55k介導對Daxx的抑制作用；另一方面，它可被E1B-55k招募到感染細胞的不溶性核部分與Daxx相互作用，共同促進Daxx的翻譯后修飾(posttranslational modification，PTM)，抑制Daxx這一抗病毒因子的功能[6]。Li Q等研究發現在卵巢癌細胞中E1B-55k蛋白能與Daxx結合，并誘導Daxx的降解[4]。其中，E1B-55k能增強順鉑對卵巢癌細胞的毒性，且Daxx的表達與卵巢癌的耐藥表型相關。在對順鉑敏感的卵巢癌細胞中，E1B-55k可通過介導Daxx降解激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)Caspase3和Caspase8外源性凋亡信號通路，從而誘導細胞凋亡。同時，當通過E1B-55k降低Daxx的表達或通過小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)敲除Daxx時，卵巢癌細胞和腫瘤標本可增加對順鉑的敏感性[4]，這表明Daxx在卵巢癌細胞中具有凋亡相關功能。此外Kang S等人研究發現，只有當Daxx由于E1B-55k降解時，才能有效的維持腺病毒的復制。因此，當采用不表達E1B-55k的溶瘤腺病毒作為基因遞送工具時，將引起Daxx沉默[9]。

HAdV E4 ORF3具有SUMO E3連接酶的功能，它可直接促進多種細胞蛋白與SUMO的結合及細胞蛋白的重新定位。在被感染的細胞中，只有靶蛋白招募到E4 ORF3聚合體時，才可發生SUMO修飾[10]。不僅如此，在干擾素(Interferon，IFN)誘導抗病毒感染期間，HAdV DNA的復制也需要E4 ORF3蛋白的存在。Ullman AJ等人用短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)干擾人纖維肉瘤HT1080細胞內Daxx表達時，E4 ORF3突變株的復制可恢復到未受刺激細胞中所觀察到的水平。表明在E4 ORF3蛋白拮抗IFN誘導的抗病毒應答時，IFN誘導抗病毒效應物即Daxx抑制E4 ORF3突變株的復制。但有趣的是，IFN誘導的抗病毒狀態對HAdV早期基因轉錄的影響并不大[11]。且HAdV E4 ORF3蛋白可通過重組PML NBs，重新定位PML和Daxx，破壞與靶蛋白相關的抗病毒特性[12]。其中，PML將重新定位為類似于核纖維的結構[13]。HAdV E4 ORE3蛋白通過拮抗PML和Daxx介導的先天性抗病毒反應，對病毒的后續表達產生積極影響[11]。另Freudenberger N等人發現，在感染過程中，衣殼蛋白VI也可通過調節轉錄因子Daxx調節抗病毒反應[14]。以上表明，Daxx與HAdV E1B-55k、HAdV E4 ORF3等蛋白直接或間接作用，抑制或促進抗病毒效應的發揮。

2 Daxx與人巨細胞病毒蛋白

HCMV 被膜蛋白pp71(Phosphoprotein 71，pp71)是一種主要的病毒反激活磷酸蛋白，當其被釋放進入細胞時，它能激活HCMV主要即刻早期啟動子(Major immediate-early promoter，MIEP)啟動病毒轉錄，對HCMV裂解復制周期的啟動具有重要作用[15]。研究表明，在HCMV感染期間，PML NBs駐留蛋白可沉默病毒即刻早期(Immediate-early，IE)基因的表達。PML、SP100是IFN-β抗病毒活性的關鍵調節因子，但Daxx不能降低IFN-β的抗病毒能力[16]。而在IFN-β背景之外，Daxx是細胞內防御抑制HCMV IE轉錄的組成部分，Daxx可通過招募組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase, HDACs)至MIEP周圍，形成由組蛋白特異性翻譯修飾產生的抑制性染色質結構，沉默MIEP介導IE基因表達的下調[6，17]。但這種抗病毒機制能被pp71被膜蛋白有效中和[17]后，病毒即刻早期基因表達將得以促進。pp71被膜蛋白主要通過以下兩條途徑緩解MIEP的沉默，從而拮抗Daxx對病毒表達的抑制作用：1)與Daxx相互作用定位于PML NBs導致Daxx沿蛋白酶體降解；2)與Daxx結合誘導其SUMO化修飾[15，18]。研究表明，在pp71介導Daxx降解時，需要20S核心顆粒(Core particle，CP)和19S調控顆粒(Regulatory particle，RP)的參與[19]。而在Daxx被降解之前，ATRX與Daxx結合并定位于PML NBs，其中ATRX也是細胞內防御抑制HCMV IE轉錄的組成部分。但細胞感染HCMV后，pp71可將與Daxx結合的ATRX從PML NBs中置換出來，并將其分散至細胞核中，從而緩解Daxx、ATRX對IE基因表達的抑制作用，這對HCMV病毒基因表達的有效啟動十分重要[20-21]。值得一提的是在未分化的人急性單核細胞白血病細胞THP-1感染HCMV后，經shRNA介導Daxx、PML、Sp100蛋白的缺失不會影響病毒IE基因表達的啟動。但當其向巨噬細胞分化后，PML NBs駐留蛋白的缺失可引起啟動病毒基因表達細胞數量的顯著增加。當Daxx缺失時，其增強作用遠超其它蛋白，約為另外兩種蛋白的20倍[17]。該現象表明Daxx、PML和Sp100是IE基因表達的制約因素，但與HCMV潛伏期的建立關系不大。

HCMV IE1蛋白也稱IE72蛋白，在pp71降解過程中其正反饋能維持MIEP的表達[15]。它可通過與PML相互作用拮抗PML NBs駐留蛋白引起的沉默，且與pp71拮抗MIEP沉默作用的機制不同[22]。不僅如此，當感染復數(Multiplicities of infection，MOIs)較低時，該蛋白對HCMV的有效裂解感染具有重要意義[15]。Poole EL等研究表明，延遲相關基因產物LUNA(Latency unique natural antigen，LUNA)為一種半胱氨酸蛋白酶，具有脫羧酶的活性，它可提高病毒再活化的效率。在HCMV再活化早期，其病毒活性可引起IE基因的強烈表達，這將對病毒再活化下游產生影響[23]。在HCMV裂解感染階段，IE1蛋白能介導LUNA啟動子的激活[24]。其中，LUNA在HCMV潛伏期、細胞裂解期均可表達，但Daxx能依賴ATRX抑制LUNA基因的表達[24]。不僅如此，HCMV潛伏期PML NBs的擴散對LUNA具有依賴性。但LUNA可通過其脫羧酶活性，在潛伏期消除細胞中潛在抗病毒的PML NBs結構[23]，因此處于潛伏期的HCMV可通過其編碼的LUNA有效的重新激活。有趣的是，IE1可通過直接的物理作用抑制Daxx與LUNA啟動子的特異性結合，從而阻止Daxx對LUNA表達的抑制作用。該物理作用包括IE1與Daxx的相互作用及IE1與HDACs相互作用激活LUNA基因的表達。

3 Daxx與人乳頭瘤病毒蛋白

HPV E2、E6蛋白是HPV的早期表達蛋白，能與細胞蛋白或轉錄因子相互作用，參與細胞凋亡、病毒基因復制和轉錄、誘導細胞惡化等[25]。其中E2蛋白是病毒在細胞內進行復制所必需的，它能招募DNA解旋酶E1到復制起始點并定位于HPV復制中心，且能不依賴PML與部分Daxx發生共定位[26]。研究表明，Daxx能與HPV16 E2蛋白在人宮頸癌Caski細胞內外結合，并共定位于胞漿與胞核[27]，且E6蛋白也可與Daxx共定位并影響其功能[28]。E6蛋白可抑制人宮頸癌HeLa細胞的凋亡，但Daxx高表達時，E6蛋白的抑制作用會發生下調。在轉染HPV16 E6的HeLa細胞中，E6蛋白可使核內部分Daxx轉位至細胞漿[28]。而Daxx位置的轉移，勢必對其本身及病毒基因的表達造成一定影響。

在病毒感染早期，HPV晚期表達蛋白L2能促進病毒基因組入核聚集于PML NBs啟動病毒轉錄，招募L1至PML NBs與病毒基因組一同完成病毒的組裝，其存在可促進HPV病毒樣顆粒(Virus-like particle，VLP)的高效組裝及核定位，有利于HPV病毒的感染[29]。Florin L等通過免疫共沉淀等方法證明，HPV L2蛋白可直接或通過中介體與Daxx發生相互作用，并誘導PML NBs重組改變其蛋白組成。在L2存在的條件下，L2能與Daxx共定位并誘導其進入PML NBs發生大量聚集。至于L2通過何種機制招募Daxx，仍需進一步的研究和探索。

在被HAdV、HCMV感染后，Daxx能抑制病毒基因表達產生抗病毒反應。在HPV感染中，Daxx也能影響HPV基因組的轉錄和調控。在人成骨肉瘤U2OS細胞中，它可調節HPV基因組早期基因的表達和瞬態復制。Daxx正常表達時，HPV基因組在U2OS細胞中具有轉錄活性，但當Daxx被敲除后，HPV DNA病毒早期基因轉錄表達降低。Kivipold P等通過干擾Daxx RNA下調Daxx表達，發現病毒DNA的復制降低了2～3倍[26]，且在原代人角質形成HFKs細胞中，敲除Daxx也可導致HPV病毒轉錄及病毒DNA復制的降低[30]。

4 Daxx與其它皰疹病毒蛋白

在Ⅰ型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus type 1，HSV-1)感染時，Daxx可與ATRX相互作用形成復合物，并以一種類似于在HCMV中的方式參與細胞對HSV-1感染的內在防御，但HSV-1立即早期蛋白ICP0可以抵消這種抗病毒作用[31-32]。其中，ICP0為病毒及細胞基因轉錄的積極調控因子，而攜帶病毒DNA的PML NBs(viral DNA-containing PML NBs，vDCP NBs)含有Daxx和ATRX，因此這兩種成分可能參與HSV-1基因的染色質化及保持已染色質化的HSV-1基因[33]。另有研究表明，HSV-1立即早期蛋白ICP27也可與Daxx結合，抑制Daxx的SUMO化，提高Daxx從胞核至胞質的易位，并增強Daxx所介導的p65去乙酰化，從而抑制NF-κB的轉錄活性[34]。

在卡波西肉瘤相關皰疹病毒(Kaposi’s Sarcoma Associated Herpesvirus，KSHV)潛伏感染期間，需依賴潛伏期相關核心抗原(Latency Associated Nuclear Antigen，LANA)維持病毒附加體的穩定。其中，LANA是一種形成寡聚體的結構，該結構本身及其形成的聚集結構均可與Daxx發生共定位。當Daxx在LANA核體中時，能對大型復合蛋白和核酸復合物的形成及穩定產生促進作用[35]。

恒河猴皰疹病毒(The rhesus monkey rhadinovirus，RRV)與KSHV密切相關，它主要以降解Sp100等途徑避免PML NBs介導的抑制作用，但仍受Daxx的限制。當Daxx被敲除后，RRV感染及復制將顯著增加[36]。

與KSHV同屬γ皰疹病毒家族的EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)可編碼主要被膜蛋白p140即BNRF1蛋白，該蛋白可刺激ICP0缺失突變型HSV-1和pp71缺陷型HCMV病毒的復制[21]，也可破壞ATRX-Daxx的相互作用。且BNRF1能與Daxx-H3.3-H4結合，對BNRF1定位到PML NBs及EBV潛伏期選擇性病毒基因表達至關重要[37]。

5 Daxx與其它病毒表達蛋白

除了以上所提及的病毒蛋白，Daxx還能與其它病毒蛋白相互作用。最近有研究表明，桿狀病毒可表達反式激活蛋白IE2，它能通過Daxx與病毒DNA相互作用，形成一個新的核體作用于非洲綠猴腎細胞Vero基因的激活。當桿狀病毒轉導Vero E6細胞時，Daxx與組蛋白H3.3可捕獲病毒DNA導致基因失活。在轉導早期，IE2可通過SUMO化作用基序形成獨特的核體結構。該結構的形成依賴Daxx，可逐漸增大引起病毒活化。即IE2可通過Daxx/H3.3復合物有效靶向病毒DNA并激活。存在IE2的轉導后期，Daxx和H3.3可與病毒DNA分離[38]。

雖然Daxx能與許多病毒蛋白作用并產生影響，有研究認為在梅克細胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus，MCPyV)感染時，Daxx對MCPyV DNA復制并無影響，因病毒復制的負調控因子為Sp100[39]。

6 展 望

DNA病毒感染可引起多種疾病，某些病毒可導致惡性腫瘤甚至引發死亡。目前，雖已明確Daxx能與一些DNA病毒的表達蛋白相互作用，如人腺病毒的E1B-55kDa及E4 ORF3蛋白、人巨細胞病毒的pp71及IE1蛋白、人乳頭瘤病毒的早期及晚期表達蛋白等。但在不同DNA病毒感染時，Daxx對病毒基因表達所起的作用并不一致。而當Daxx與病毒蛋白發生相互作用時，將對Daxx的功能及病毒基因的表達造成某些影響。因此，仍需進一步研究并探索Daxx與各種DNA病毒及其表達蛋白間的相互作用，以確定Daxx對致病病毒表達是否起作用、能否與病毒基因表達的蛋白發生相互作用等，這對預防DNA病毒的感染及治療有一定的意義。

利益沖突：無