結核分枝桿菌異煙肼和丙硫異煙胺耐藥及其交叉耐藥相關機制研究進展

王曉英，張匯征，羅 明,曾婉婷

結核病是一種由結核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis，MTB)感染引起的慢性傳染病，是由單一致病菌引起的死亡人數最多的疾病[1]。我國結核病疫情嚴重，僅次于印度，居世界第2位。據世界衛生組織(World Healthy Orgnization，WHO)估算，2018年全球新發結核病患者數為1 000萬，耐多藥(Multi-Drug Resistant，MDR)結核病患者數為48.4萬[2]。MDR患者化療療程約為20個月或更長，但治療效果卻不理想，治療成功率僅為54%，病死率達16%。2010年全國第5次結核病流行病學抽樣調查報告顯示，我國結核病患者對異煙肼(isoniazid, INH)的總耐藥率最高，達28.6%，對二線抗結核藥物丙硫異煙胺(prothionamide, Pto)的總耐藥率達12.9%，總耐藥順位分別排第1位和第4位；其中，初治肺結核患者INH與Pto的耐藥率分別為第1位和第4位，復治肺結核患者INH與Pto的耐藥率分別為第1位和第5位[3]。由此可見，我國INH與Pto的耐藥情況已經非常嚴峻。快速準確的預測結核病患者對抗結核藥物的耐藥性，有助于患者及時有效的治療。結核病耐藥的快速檢測依賴于對耐藥機制的研究，因此，充分了解INH和Pto交叉耐藥的相關機制，有助于對這兩種藥物耐藥性的精確檢測和其臨床上的合理使用。

1 異煙肼及丙硫異煙胺作用機理

1.1異煙肼作用機理 INH是目前使用的重要一線抗結核藥物，是一種需要經過氧化反應才能變得有活性的前體藥物。INH作用于MTB細胞壁分枝菌酸的合成，它通過抑制參與MTB細胞壁生物合成的烯酰基載體蛋白還原酶inhA而達到殺菌的功效[4]。INH易滲入吞噬細胞，對細胞內外的MTB均有殺菌作用，故稱“全效殺菌藥”[5]。

1.2丙硫異煙胺作用機理 MTB對INH耐藥后，臨床上通常用Pto來代替INH組成治療方案[5]。Pto屬于口服抑菌二線抗結核藥物，也是一種前體藥物，被廣泛用于耐多藥結核病、敏感菌導致的結核性腦膜炎及粟粒性結核等多種結核病的治療中[6-7], 也適用于非結核分枝桿菌病的治療[5]。Pto與乙硫異煙胺(Ethionamide, Eto)均屬硫胺類藥物，為異煙酸的衍生物，可通過抑制MTB分枝菌酸的合成并擾亂MTB細胞膜的合成而發揮抗結核功效[5,7-8]。

2 異煙肼和丙硫異煙胺交叉耐藥機制

Pto與Eto顯示出高度的交叉耐藥性，因此，Eto耐藥相關基因突變成為研究Pto耐藥機制的主要依據。Pto、Eto與INH的作用相似，存在部分的交叉耐藥性[9]。

2.1inhA基因 INH和Pto均屬于前體藥物，需要不同的酶進行活化后才能發揮作用，但兩種藥物有共同的作用靶點：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD),NADH依賴的烯酰基乙酰載體蛋白還原酶，涉及到分枝菌酸合成的inhA[10-11]。inhA基因編碼分枝桿菌脂肪酸合成酶II系統中的一種烯酰基乙酰載體蛋白還原酶，激活的INH共價結合到NAD上形成加合物而附著到inhA上[12]。因此，inhA基因或/和inhA啟動子區域基因突變可導致inhA基因編碼產物的過表達或者修飾，降低了inhA酶與NADH的親和力，從而造成INH與Pto的交叉耐藥[13-15]。研究表明，在INH與Pto同時耐藥的菌株中，33.5%的菌株存在INH與Pto交叉耐藥的情況，由inhA和/或其啟動子區域的單一突變或者兩者同時突變導致；交叉耐藥菌株中，最常見的突變為inhA啟動子區域-C15T突變，占26%。但在INH耐藥Pto敏感或INH敏感Pto耐藥菌株中，存在3例inhA啟動子-C15T突變的情況，可能與其他調整因子的代償突變有關[16]。

目前關于INH與Pto交叉耐藥的研究較少，多是關于INH與Eto交叉耐藥情況的研究。一項關于INH與Eto交叉耐藥的研究表明，94%的MDR菌株在inhA啟動子區域存在突變，突變類型為-C15T[17]。而另一項關于INH與Eto交叉耐藥的研究表明，33.3%Eto耐藥的MDR菌株中存在inhA啟動子區域或inhA基因突變，在66.6%的交叉耐藥菌株中可見inhA啟動子區域-C15T突變[18]。而南非東開普省的研究表明，inhA啟動子區域-C17T突變在XDR-TB菌株中是主要的突變類型，達到83%[19]。inhA基因編碼區域突變比較少見，目前研究表明，在INH和Eto交叉耐藥菌株中，inhA基因編碼區域氨基酸突變位點僅有I21T, S94A和I95P[20-21]。但inhA基因突變及其啟動子區域突變導致的交叉耐藥在不同地區的差異很大，從12%到100%不等[20, 22-26]。

2.2ndh基因ndh基因編碼NADH脫氫酶，其在恥垢分枝桿菌的研究中首次被認為與INH的耐藥機制有關。研究表明，ndh基因編碼的NADH脫氫酶對于恥垢分枝桿菌的存活至關重要，而NADH脫氫酶通過將NADH氧化成NAD+而提高INH的活性[27]。隨后的研究表明，ndh基因突變只出現在INH耐藥的MTB菌株中，說明ndh基因突變與MTB對INH耐藥有關。ndh基因突變降低了NADH氧化成NAD+的速率，從而導致了NADH的累積以及NAD的缺乏[28]，增加的NADH水平可能競爭性的抑制了INH-NAD加合物附著到inhA酶的活性位點[29-30]，從而破壞了酶活性的調整并可能引起INH和Pto的交叉耐藥[31]。也可能因為NADH是過氧化物酶AhpCF和KatG的底物，NADH濃度的增加可能競爭性抑制KatG對INH的過氧化作用[27]。Miesel等人的研究也表明增加的NADH濃度阻止了INH和Eto的作用從而導致高水平耐藥[27]。

在恥垢分枝桿菌和牛分枝桿菌中已經發現ndh基因突變可導致INH與Eto交叉耐藥[32]。來自新加坡和巴西的研究也表明ndh突變(R13C、T110A和R268H)發生在8%～10%的異煙肼耐藥菌株中，但并不存在于INH敏感的菌株中[28,33]。但其他相關研究表明，ndh突變在INH耐藥和敏感菌株中均存在[20]。最新的關于結核分枝桿菌INH和Pto交叉耐藥的研究中，僅在ndh基因中新發現了一個非同義突變(G339A)，且其僅與INH耐藥相關[16]。因此，目前ndh突變與INH和Pto交叉耐藥的相關性并不是很明確，還需要進一步的研究來證實。

2.3fabG1-inhA基因fabG1基因(又稱為mabA)g609a突變首先被發現與INH耐藥相關[34]。fabG1基因沉默突變導致INH和ETH耐藥。fabG1基因g609a突變及與它臨近的區域扮演了inhA基因啟動子的作用，增強inhA的轉錄，導致inhA的過表達，降低了inhA酶與NADH的親和力，從而導致INH和ETH的交叉耐藥。fabG1基因g609a突變也可能通過增加轉錄的穩定性和改變RNase在mabA-inhA mRNA中的裂解位點來影響inhA轉錄的水平，最終導致INH和ETH的交叉耐藥[35]。fabG1基因突變已被用于預測MTB對INH耐藥的檢測中[36]，但目前MTB對Pto耐藥及INH與Pto交叉耐藥相關研究中并未對fabG1基因突變情況進行檢測[16,37]。因此，fabG1基因突變是否與INH和Pto的交叉耐藥相關以及其相關的耐藥機制，還需要進一步的實驗驗證。

3 異煙肼耐藥的其它機制

除與Pto交叉耐藥的相關機制外，導致MTB對INH耐藥的主要分子機制主要與katG、ahpC、kasA和oxyR等基因突變有關。katG基因突變導致過氧化氫酶-過氧化物酶的形成受阻，不能活化INH為具有殺菌作用的異煙酸，從而導致MTB對INH耐藥[38-39]。最常見的KatG突變為S315T突變，94%的INH耐藥菌株與S315T突變相關[40]。各個地區INH耐藥菌株中因katG基因突變而導致的耐藥比率差異很大，從31.8%～96.9%不等[41]。ahpC基因在INH耐藥中起著重要的作用。由ahpC基因編碼的AhpC酶(alkyl hydro peroxidase)引起過氧化氫底物的減少，ahpC基因啟動子區域的突變能夠增強ahpC蛋白的表達，從而代償性抵抗KatG/CP活性的丟失[42]。oxyR是一種氧化應激調節蛋白，控制著編碼解毒酶基因觸酶-過氧化物酶(katG編碼)和烷基氫過氧化物酶(ahpC編碼)的表達[43]。29%的INH耐藥臨床株在oxyR-ahpC基因間隔區存在突變[43]，oxyR-ahpC基因間隔區突變，例如-G9A和-C15T可分別增加ahpC的表達達9倍和18倍[42]。但oxyR-ahpC基因間隔區突變是否與INH耐藥相關目前還存在爭議[44]。kasA基因編碼的KasA(β-酮脂酰基酰載體蛋白合成酶) 能促進分枝菌酸的生物合成[25]，但kasA基因突變在INH耐藥中的作用并不是很清楚[34,45-46]。因此，INH耐藥菌株相關基因(如ahpC、kasA和oxyR)突變的具體位點及其與INH臨床耐藥的確切關系還不是很明確，需要進行更深入的研究。

4 丙硫異煙胺耐藥的其它機制

除與INH交叉耐藥的機制外，Pto耐藥主要與ethA、ethR和mshA等基因突變有關。ethA基因可編碼加單氧酶ethA，Pto經加單氧酶ethA激活后與NAD+反應，產生 Pto-NAD加合物，從而抑制inhA基因及分枝菌酸的合成[47-50]。Brossier等的研究結果表明，47%的Eto耐藥菌株存在ethA基因突變(F110L和 A95T突變)[31]。多項研究表明，ethA基因的非同義突變和框架突變可導致Pto/Eto耐藥，所占比例從37%到100%不等[15,25,37,51]。另外，Islam等的研究發現了ethA基因上29個新的非同義突變和3個截斷突變與Pto的耐藥相關[16]。ethR是TetR/CamR家族的一員,可抑制ethA基因的表達[52]。抑制ethR基因的功能將導致MTB對Pto的敏感性提高，而ethR基因突變則會導致Pto耐藥[49]。ethR基因突變(F110L和 A95T)與Eto耐藥相關，約占Eto耐藥菌株的4%[31]。ethR基因上兩個新的非同義突變 (R216C和V152M)和一個同義突變也被證實與Pto耐藥相關[16]。mshA屬于糖基轉移酶家族，涉及到MTB分枝硫醇的生物合成[11]，mshA基因突變可能與Pto/Eto的激活被破壞有關[11,15,31]，但mshA基因突變與Pto/Eto耐藥的相關性并不是很明確，有待進一步的研究。目前，MTB對Pto耐藥的相關機制研究較少，多基于對Eto耐藥機制的研究，相關基因突變的具體位點及其與臨床耐藥的相關性仍需要進行更深入的研究。

5 展 望

隨著分子生物學技術的發展，INH的耐藥機制也越來越明確，但目前MTB對Pto耐藥相關突變基因以及突變位點的分析仍然非常有限，還存在未知的基因突變。已有研究表明，20.2%的Pto耐藥菌株中未發現已知的基因突變[16]，在未知的耐藥基因突變中也有可能存在與INH交叉耐藥相關的機制。另外，MTB因受各種因素的影響，其遺傳特點多存在顯著的地域差異。目前，我國INH和Pto耐藥情況已經比較嚴峻，尤其是兩者之間存在著交叉耐藥的情況。對于INH和Pto交叉耐藥機制的研究也十分有限，需要進行更加深入的研究以探索其作用的新機制。對INH與Pto交叉耐藥機制的研究可為結核病相關耐藥基因檢測技術的發展提供參考，為耐藥結核病的診斷及臨床醫生的合理用藥提供科學依據。

利益沖突：無。