小花清風藤中黃酮類成分的研究

潘國吉孫慶文徐文芬柏彩紅劉夢鴿陸 祥張 葉

（貴州中醫藥大學，貴州 貴陽550025）

小花清風藤Sabia parvifloraWall.ex.Roxb.屬于清風藤科清風藤屬植物，為貴州省2003 年版《中藥材、民族藥材質量標準》 收載品種。國內主要分布于貴州西南部、云南東南部至西南部、廣西西部及西南部［1］。在貴州西南地區，苗族、布依族用小花清風藤的莖藤治療風濕關節痛、跌打損傷痛、肝炎等［2-3］。通過查閱整理相關的文獻資料可知，小花清風藤中主要含有五環三萜類［4-7］、生物堿類［8-10］、黃酮類［11-12］和揮發油類［13］等。其中黃酮類化合物具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖、抗炎及抑菌抗病毒等藥理作用，極有可能是該藥材發揮藥效作用的成分類群之一。而小花清風藤藥材現報道的黃酮類成分僅有蘆丁、槲皮素、芹菜素、山柰酚、木犀草素等，因大多數藥材均含有以上幾種黃酮類成分，選擇其作為該藥材質量控制指標缺乏專屬性，難于客觀評價藥材的優劣。鑒于此，本研究結合多種色譜分離技術，進一步挖掘小花清風藤藥材中黃酮類成分，以期發現結構新穎且具有生物活性的黃酮類化合物，為建立該藥材多指標質量控制方法及其藥效物質基礎研究提供依據。

1 材料

WNMR-Ⅰ600 MHz 核磁共振波譜儀（中國科學院武漢物理與數學研究所）；超高壓液相色譜三重四級桿串聯質譜儀（美國Waters 公司）；Therom Ultimate -3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；分析和半制備型高效液相色譜儀為Agilent 1100 型（美國Agilent 公司）；RE-5210 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化有限公司）；BuchiR-215 型旋轉蒸發儀（瑞士Buchi 公司）；AG135 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。

實驗藥材于2017 年6 月采自貴州省鎮寧縣，原植物經貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為清風藤科清風藤屬植物小花清風藤Sabia parvifloraWall.ex.Roxb.，植物憑證標本（P-201708001）保存于貴州中醫藥大學生藥實驗室。

2 提取與分離

將自然干燥的小花清風藤莖和葉（11.22 kg），經粉碎機粉碎，得粗粉（10.8 kg），用甲醇回流提取3 次（2 h ／次），合并濾液，減壓濃縮至無醇味，加水溶解，上樣于D-101 大孔樹脂，依次用25%、70%、100%甲醇溶液洗脫，濃縮，干燥，得浸膏（25% 甲醇洗脫部位0.75 kg、70% 甲醇洗脫部位1.67 kg 和100% 甲醇洗脫部位1.17 kg）。取適量70%甲醇洗脫部位浸膏經硅膠色譜柱分離，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得2 個組分Fr.1-1～1-2。Fr.1-1 過硅膠色譜柱，經二氯甲烷-甲醇（20∶1～4）洗脫，再經制備HPLC 甲醇-水（60∶40）得化合物5（46 mg）、6（62 mg）、7（41 mg）；Fr.1-2 經ODSA-HG 反相色譜柱，甲醇-水（3∶7）洗脫，得組分Fr.1-2-1 和Fr.1-2-2。Fr.1-2-1 經制備HPLC 甲醇-水（60∶40）洗脫，得化合物3（137 mg）、4（89 mg），Fr.1-2-2 經制備HPLC 甲醇-水（50∶50）洗脫，得化合物1（59 mg）、2（153 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：黃色粉末，鹽酸鎂粉反應陽性，Molish 反應陽性；ESI-MSm／z：649.4 ［M＋Na］＋、625.3［M-H］-，UV λmax 為256 nm（帶Ⅱ），355 nm（帶Ⅰ）。相對分子量626，分子式C27H30O17。1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.57（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2′），7.56（1H，dd，J＝8.8，2.0 Hz，H-6′），6.84（1H，d，J＝8.8 Hz，H-5′），6.37（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），6.17（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），5.40（1H，d，J＝7.2 Hz，Glu H-1），4.06（1H，d，J＝7.8 Hz，Glu H-1）；13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ：156.4（C-2），133.3（C-3），177.3（C-4），161.2（C-5），98.8（C-6），164.5（C-7），93.7（C-8），156.3（C-9），104.0（C-10），121.1（C-1′），115.3（C-2′），144.8（C-3′），148.6（C-4′），116.2（C-5′），121.7（C-6′），100.9（Glu C-1），73.4（Glu C-2），76.5（Glu C-3），69.8（Glu C-4），76.4（Glu C-5），68.1（Glu C-6），103.1（Glu C-1），74.0（Glu C-2），76.5（Glu C-3），69.7（Glu C-4），76.4（Glu C-5），60.7（Glu 5-CH3）。以上數據與文獻［14-15］基本一致，故鑒定為槲皮素-3-O-龍膽雙糖苷。

化合物2：黃色粉末，鹽酸鎂粉反應陽性，Molish 反應陽性；ESI-MSm／z：765.1 ［M＋Na］＋、741.3 ［M-H］-，UV λmax 為256 nm（帶Ⅱ），355 nm（帶Ⅰ）；相對分子量742，分子式C32H38O20。1HNMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：7.70（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2′），6.87（1H，d，J＝8.5 Hz，H-5′），7.62（1H，dd，J＝12.0，2 Hz，H-6′），6.36（1H，d，J＝2.0 Hz，H-8），6.18（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），4.55（1H，d，J＝1.0 Hz，Rha H-1），4.38（1H，d，J＝7.5 Hz，Xyl H-1），1.13（3H，d，J＝5.9 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，Methanol-d4）δ：159.2（C-2），135.5（C-3），179.1（C-4），162.7（C-5），100.3（C-6），166.6（C-7），95.2（C-8），158.5（C-9），105.3（C-10），123.1（C-1′），117.8（C-2′），145.7（C-3′），149.7（C-4′），116.1（C-5′），123.5（C-6′），104.7（Glu C-1），75.7（Glu C-2），78.1（Glu C-3），71.6（Glu C-4），77.1（Glu C-5），68.9（Glu C-6），102.3（Rha C-1），71.5（Rha C-2），82.4（Rha C-3），72.7（Rha C-4），69.4（Rha C-5），17.9（Rha 5-CH3），106.4（Xyl C-1），75.2（Xyl C-2），77.5（Xyl C-3），71.0（Xyl C-4），66.8（Xyl C-5）。以上數據與文獻［16］基本一致，故鑒定為camellianoside。

化合物3：黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應呈陽性，Molish 反應陽性；ESI-MSm／z：632.9 ［M＋Na］＋、609.4 ［M-H］-，UV λmax 為256 nm（帶Ⅱ），355 nm（帶Ⅰ）；相對分子量610，分子式C27H30O16。1HNMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：7.62（1H，d，J＝8.5 Hz，H-6′），6.87（1H，d，J＝8.5 Hz，H-5′），6.35（1H，s，H-8），6.17（1H，s，H-6），5.11（1H，d，J＝7.4 Hz，Glu H-1），4.55（1H，Rha H-1），1.14（3H，d，J＝6.3 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，Methanol-d4）δ：158.3（C-2），135.6（C-3），179.2（C-4），162.7（C-5），99.9（C-6），165.8（C-7），94.9（C-8），159.2（C-9），105.5（C-10），123.6（C-1′），117.7（C-2′），145.6（C-3′），149.7（C-4′），116.0（C-5′），123.1（C-6′），104.7（Glu C-1），73.9（Glu C-2），78.1（Glu C-3），69.6（Glu C-4），77.1（Glu C-5），68.5（Glu C-6），102.3（Rha C-1），72.2（Rha C-2），72.0（Rha C-3），75.7（Rha C-4），71.3（Rha C-5），17.9（Rha 5-CH3）。以上數據與文獻［17］基本一致，故鑒定為蘆丁。

化合物4：棕色結晶，鹽酸-鎂粉反應呈陽性，Molish 反應陽性；ESI-MSm／z：749.1 ［M＋Na］＋、725.2 ［M-H］-，UV λmax 為265 nm（帶Ⅱ），346 nm（帶Ⅰ）；相對分子量726，分子式C32H38O19。1HNMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：8.07（1H，s，H-6′），8.04（1H，s，H-2′），6.89（1H，d，J＝2.0 Hz，H-3′），6.89（1H，d，J＝2.0 Hz，H-5′），6.37（1H，d，J＝2.0 Hz，H-8），6.19（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），5.11（1H，d，J＝7.1 Hz，Glu H-1），4.52（1H，d，J＝1.6 Hz，Rha H-1），4.34（1H，d，J＝7.4 Hz，Xyl H-1），1.11（3H，d，J＝6.0 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，Methanol-d4）δ：159.4（C-2），135.4（C-3），179.2（C-4），162.9（C-5），100.1（C-6），166.1（C-7），95.1（C-8），158.5（C-9），105.6（C-10），122.7（C-1′），132.4（C-2′），116.1（C-3′），161.4（C-4′），116.1（C-5′），132.4（C-6′），104.5（Glu C-1），75.7（Glu C-2），78.1（Glu C-3），71.7（Glu C-4），77.1（Glu C-5），69.0（Glu C-6），102.2（Rha C-1），71.7（Rha C-2），82.4（Rha C-3），72.7（Rha C-4），69.5（Rha C-5），17.9（Rha 5-CH3），106.3（Xyl C-1），75.3（Xyl C-2），77.5（Xyl C-3），71.0（Xyl C-4），66.8（Xyl C-5）。以上數據與文獻［18］基本一致，故鑒定為tsubakioside A。

化合物5：黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應呈陽性，Molish 反應陽性；ESI-MSm／z：616.8 ［M＋Na］＋、592.7 ［M-H］-，UV λmax 為265 nm（帶Ⅱ），346 nm（帶Ⅰ）；相對分子量594，分子式C27H30O15。1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.56（1H，s，5-OH）10，10.85（1H，s，7-OH），10.13（1H，s，4′-OH），7.98（1H，m，H-2′，6′），6.88（1H，m，H-3′，5′），6.88（1H，d，J＝8.9 Hz，），6.41（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），6.20（1H，d，J＝2.1 Hz，H-6），5.31（1H，d，J＝7.6 Hz，Glu H-1），4.，37（1H，d，J＝1.5 Hz，Rha H-1），0.98（3H，d，J＝6.2 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ：156.9（C-2），133.3（C-3），177.4（C-4），161.2（C-5），98.8（C-6），164.1（C-7），93.8（C-8），156.5（C-9），104.0（C-10），120.9（C-1′），130.9（C-2′），115.1（C-3′），159.9（C-4′），115.1（C-5′），130.9（C-6′），101.4（Glu C-1），74.2（Glu C-2），75.8（Glu C-3），71.8（Glu C-4），76.4（Glu C-5），66.9（Glu C-6），100.8（Rha C-1），70.6（Rha C-2），70.4（Rha C-3），71.8（Rha C-4），68.3（Rha C-5），17.8（Rha 5-CH3）。以上數據與文獻［19］基本一致，故鑒定為山柰酚-3-O-蕓香糖苷。

化合物6：黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應呈陽性，Molish 反應陽性；ESI-MSm／z：647.4 ［M＋Na］＋、623.0 ［M-H］-，UV λmax 為257 nm（帶Ⅱ），357 nm（帶Ⅰ）；相對分子量624，分子式C28H32O16。1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.57（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2′），6.85（1H，d，J＝8.1 Hz，H-5′），6.66（1H，d，J＝2.3 Hz，H-8），6.35（1H，d，J＝2.3 Hz，H-6），5.35（1H，d，J＝7.1 Hz，Glu H-1），4.37（1H，d，J＝1.2 Hz，Rha H-1），3.85（3H，s，3′-OCH3），0.97（3H，d，J＝6.2 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ：157.0（C-2），133.6（C-3），177.6（C-4），160.9（C-5），98.0（C-6），165.2（C-7），92.3（C-8），156.5（C-9），105.1（C-10），121.2（C-1′），115.3（C-2′），144.9（C-3′），148.6（C-4′），116.5（C-5′），121.8（C-6′），101.2（Glu C-1），74.1（Glu C-2），76.1（Glu C-3），70.2（Glu C-4），76.5（Glu C-5），67.1（Glu C-6），100.8（Rha C-1），70.5（Rha C-2），70.7（Rha C-3），71.9（Rha C-4），68.3（Rha C-5），17.83（Rha 5-CH3）。以上數據與文獻［20］基本一致，故鑒定為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷。

化合物7：黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應呈陽性，Molish 反應陽性；ESI-MSm／z：309.2 ［M＋Na］＋、285.1 ［M-H］-，UV λmax 為266 nm（帶Ⅱ），366 nm（帶Ⅰ）；相對分子量286，分子式C15H10O6。1HNMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：8.06（2H，dd，J＝3.6，9.9 Hz，H-2′，H-6′），6.89（2H，dd，J＝3.6，9.9 Hz，H-3′，H-5′），6.42（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），6.18（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6）；13C-NMR（151 MHz，Methanol-d4）δ：147.0（C-2），137.1（C-3），177.3（C-4），160.5（C-5），99.2（C-6），163.8（C-7），93.4（C-8），156.2（C-9），103.2（C-10），121.7（C-1′），130.0（C-2′），116.3（C-3′），169.5（C-4′），116.3（C-5′），130.0（C-6′）。以上數據與文獻［21］基本一致，故鑒定為山柰酚。

4 討論

通過多種色譜和光譜技術相結合，從小花清風藤中分離得到7 個黃酮類化合物，其中有5 個化合物（1～2、4～6）為首次從該植物中分離得到。研究結果豐富了小花清風藤藥材的化學成分，以期為完善2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》收載品種小花清風藤藥材的質量標準及其藥效物質基礎的研究奠定基礎，同時為小花清風藤藥材綜合開發利用提供依據。