從SARS到COVID-19：進化與啟示

韓鵬宇,鄭慧芳,畢秀欣,孫殿興

1 冠狀病毒簡介

冠狀病毒(Coronavirus ，CoVs)在系統分類上屬冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬，因其外包膜突起顆粒形似冠狀而得名。CoV基因組是單股正鏈RNA(+ssRNA)，大小約為27～32 kb，序列長度在所有RNA病毒基因組中排名第2。相比其它RNA病毒，之所以CoV具有較大基因組，主要與其復制保真度有關，而龐大的基因組又進一步促進了CoV獲取額外的基因，用來編碼輔助蛋白，從而適應特定宿主[1]。因此，重組、基因交換和基因插入或刪除引起的基因組變化在CoVs中很常見。由于下一代測序技術的廣泛應用，新的CoV正在不斷被發現，病毒亞系也在迅速擴展。根據最新的國際病毒分類委員會(ICTV)分類，CoV共有4個屬(α, β, γ, δ)，由亞系的38個獨特物種組成[2]。因為目前仍然有許多未分類的CoVs, 未來CoVs的物種數量還將繼續增加[3-4]。CoVs 會導致家畜，野生動物和人類患病，其中α和β 屬CoVs主要感染哺乳類動物，γ和δ屬CoV主要感染鳥類[5]。

SARS冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome-corona virus,SARS-CoV)起源于中國，然后蔓延到世界其它地區，在2002-2003年大流行期間感染了大約8 000人，總病死率為10%。MERS冠狀病毒(Middle East Respiratory Syndrome- corona virus，MERS-CoV)自2012年在中東出現以來，傳播到27個國家，導致2 249例實驗室確診病例，平均病死率為35.5%(截至2018年9月)[6]。除上述兩種CoV外，α-CoVs 229E，NL63，β-CoVs OC43 和HKU1 也可引起較輕微的人類呼吸道疾病[7]。此外，CoVs在家畜和野生動物中也可引起疾病大流行[8-9]。豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(swine acute diarrhea syndrome corona virus, SADS-CoV)最近被確定為引發2016年廣東省清遠市豬群致死性腹瀉疫情的病因，該疫情導致2萬多頭仔豬死亡[8]。分別屬于α-CoV 和豬δ- CoV(PDCoV)的流行性豬腹瀉病毒(PEDV)和傳染性胃腸炎病毒(TGEV)是對食品產業沖擊較大的新發和再發病毒，此外，冠狀病毒也與水貂的胃腸炎(MCoV)和鯨魚死亡(BWCoV-SW1)有關[9]。

2 SARS疫情

2.1疫情概況 SARS于2002年底首次出現于中國廣東省，導致一種新型臨床重癥疾病(“非典型肺炎”)，其特征是發熱、頭痛及隨后出現的呼吸道癥狀，包括咳嗽、呼吸困難和肺炎。SARS在人類中快速傳播，迅速蔓延至中國香港及其他省份，隨后蔓延至其他28個國家[13-14]。截止2003年7月，全球范圍內共報道8 069例SARS確診病例，波及29個國家，其中死亡病例774例(9.6%)。2004年又新增4例病例，并未出現死亡病例和傳播擴散[15]。

2.2基因結構分析 冠狀病毒基因組在5′至3′的特征基因順序方向上有6～7個主要開放閱讀框(ORF)。其中，ORF1a和1b，約占CoV基因組的三分之二，負責編碼非結構多蛋白；下游4個ORF編碼結構蛋白：spike蛋白(S)、envelope蛋白(E)、membrane蛋白(M)和nucleocapsid蛋白(N)。有些冠狀病毒在ORF1b和S之間具有血凝素-酯酶(HE)基因。冠狀病毒除保守基因序列外，SARS-CoV基因組還包含許多特定的附屬基因，包括ORF3a、3b，ORF6、ORF7a、7b，ORF8a、8b和9b[16-18]。

相比SARS，MERS-CoV 編碼5種獨特的附屬基因：ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5和ORF8b。在發現MERS-CoV時，上述附屬基因均未被證明與其他已知的冠狀病毒基因相關。MERS-CoV中7個保守復制酶序列的氨基酸(aa)特征與先前發現的兩種蝙蝠冠狀病毒：BtCoV-HKU4和BtCoV-HKU5相似。根據國際病毒分類委員會(ICTV)的分類標準，SARS-CoV和MERS-CoV代表了β病毒屬中2種新的冠狀病毒物種。β冠狀病毒的成員被分成4個譜系，A、B、C和D。SARS-CoV和MERS-CoV分別聚集在譜系B和C[19-21]。

2.3 宿主

2.3.1最初猜測 流行病學調查顯示，2002-2003年“非典”早期病例和2004年出現的4例病例均有動物接觸史。分子生物學檢測和病毒分離研究顯示，引起“非典”流行的SARS-CoV可能源于在農貿市場中交易的果子貍，而后續對果子貍的大規模撲殺也使得“非典”疫情逐漸得到控制，似乎也間接印證了果子貍是非典疫情的源頭。

2.3.2后續追蹤調查 由于早期SARS病例為在餐館工作并接觸野生動物的工作人員，所以先期的調查重點為市場銷售的野生動物。研究人員調查了深圳一家動物市場，被抽查的動物包括7種野生動物和1種家養動物，它們來自中國南方的不同地區，在到達市場之前一直存放在單獨的倉庫里，這些動物在市場里停留了一段時間，每個攤主只售賣幾只特定物種的動物，研究者對市場內不同攤位的動物進行了取樣，收集鼻腔和糞便樣本，其中，從果子貍的鼻拭子中分離的兩個病毒(SZ3和SZ16)被完全測序，其全長基因組序列與人類SARS-CoV有99.8%的同源性。通過對比動物SL-CoV(SARS-like CoV)病毒與人類SARS-CoV的S基因發現，動物病毒與人類病毒分屬不同譜系。完整基因組比較發現，相比于動物，人類SCoV的N基因上有29nt的刪除，刪除點位于N基因起始密碼子上游246 nt。動物病毒中額外的29nt序列導致開放閱讀框ORF10和11融合為編碼122個氨基酸的新ORF。4種動物SLCoVs和11種人類SARS-CoVs的S基因序列擁有38種核苷酸多態性，其中26種為非同義變化。4種動物SLCoVs之間的S基因有8個核苷酸差異，而11種人類病毒之間存在20個核苷酸差異。因此，動物SLCoVs雖然是從一個市場分離的，但卻與從香港、廣東、加拿大和越南分離的人類病毒具備相似的多樣性[22]。

在2004年1月果子貍撲殺開始前，研究者在廣州市新源動物交易市場的18家供應商中，隨機挑選出91只果子貍(Paguma larvata)和15只浣熊狗(Nyctereutes procyonoides)進行采樣，通過對樣本N基因和P基因的實時熒光定量PCR和巢式RT-PCR檢測發現，所有樣本SL-CoV呈陽性反應[24]。此外，與前期研究相同的是，在人類SARS-CoV中刪除的29nt序列在此次所有動物樣本中均可檢測到。為了追蹤SL-CoV病毒的地理來源，研究者從市場銷售商聲稱的動物交易來源省份抽取了1 107只果子貍進行檢測。這些來源省市包括安徽、北京、福建、廣西、河南、河北、湖北、湖南、江蘇、江西、山西和陜西。然而，2004年1月至9月期間，采用同種方法，在以上地區采集的1 107個果子貍SL-CoV檢測卻均呈陰性[23]。新源動物市場銷售的動物種類多，包括活驢、小牛、山羊、綿羊、小豬、美國水貂、浣熊狗、養殖狐貍、豬獾、豪豬、貍獺、豚鼠、兔子和鳥類。對果子貍(2003年和2004年)和人類患者(2004年)病毒的5個主要編碼序列(ORF1ab、S、E、M和N)進行突變率分析表明，SARS-CoV和SL-CoV在人類和果子貍中以相對恒定的速率進化[24]。

當時，研究者懷疑，果子貍、浣熊狗和雪貂都是被一種迄今仍不為人知的動物宿主所感染，而由于中國南方的烹飪習俗，城市中銷售的野生動物很可能通過中間宿主傳染人類。

2.3.3跨物種傳播屏障 隨著研究的深入，人們發現血管緊張素轉化酶2(ACE2)是SARS-CoV進入細胞的受體，SARS-CoV S 蛋白的193 個氨基酸片段(aa 318-510)可有效地結合ACE2，并被定義為SARS-CoV的受體結合域(Receptor Binding Dormine，RBD)。晶體結構分析顯示， 與ACE2直接接觸的(aa 424-494)子域為受體結合引發域(Receptor Binding Motif，RBM)。在RBM中，幾個關鍵氨基酸物對受體結合至關重要，而不同SARS-CoV分離毒株中關鍵氨基酸的改變會導致其與受體結合能力的變化[25-27]。

在隨后的研究中，人們從晶體結構角度解釋了果子貍SL-CoV不能直接傳染人類的原因。人類流行性感染病毒株hTor02中的479氨基酸殘基為天冬酰胺(asparagine)，但果子貍病毒株cSz02的479氨基酸殘基為賴氨酸(lysine，Lys)。人類ACE2 Lys31 在疏水環境中與人類ACE2 Glu35 形成鹽橋，果子貍Sz02毒株的Lys479 會與人類Lys31競爭Glu35， 使受體結合不穩定。而果子貍ACE2 的Thr31不與Glu35競爭形成鹽橋，從而使得有足夠的Glu35與果子貍Sz02 Lys479形成鹽橋從而穩定結合接口，所以，擁有Lys479的果子貍病毒株對果子貍ACE2有較高的親和力，而非人類ACE2。此外，人類毒株hTro02中的487殘基為蘇氨酸(threonine)，果子貍毒株cSz02中的487殘基為絲氨酸(serine)，在疏水環境中，Lys353與人類ACE2的Asp38形成鹽橋，這個過程需要甲基化的Thr487，而低致病性的人類毒株hcGd03中的487殘基為絲氨酸，這也解釋了為何其不能在人間傳播。相比而言，果子貍ACE2 中的Glu38側鏈比人類ACE2 中的Asp38 長，在沒有甲基化Thr487支持的情況下，也可以與 Lys353 形成鹽橋，因此，帶有Ser487的果子貍病毒株可以在果子貍中傳播，但不能人傳人。因此，果子貍毒株不能感染人體細胞，因其不適應人類ACE2，而SARS-CoV已經進化，通過逐步突變在RBD上獲得可以持續感染人類細胞的氨基酸殘基479和487[28]。

2.3.4突破 為進一步探尋SARS的真正自然宿主，研究者在中國云南省昆明市的1個調查點對中華菊頭蝠 (Rhinolophus sinicus)群落進行了縱向調查(2011年4月至2012年9月)，并從蝙蝠肛拭子和糞便樣本中發現了兩種新毒株，即RsSHC014和Rs3367。毒株全長基因組序列被確定，大小均為29 787 bp(不包括多聚腺苷酸尾)。兩個新發現的毒株基因組與人類SARS-CoV(Tor 2)的基因組同源性為95%，顯著高于之前在中國(88%～92%)和歐洲觀察到的蝙蝠SL-CoVs(76%)。研究者從SL-CoV PCR陽性樣品中成功分離出活體病毒株。序列分析表明，分離出的毒株與Rs3367幾乎相同，兩者擁有 99.9%的基因同源性，而S1區氨基酸序列更是達到了100%相同。該分離株被命名為SL-CoV-WIV1。

通過病毒轉染表達和不表達ACE2的不同細胞，研究者發現WIV1能夠使用包括不同物種來源的ACE2作為受體，并在表達ACE2的細胞中有效復制。這是人類首次發現能夠使用ACE2作為受體的野生型蝙蝠SL-CoV，為證明SARS-CoV起源于蝙蝠提供了最明確的證據[29]。在另一項研究中，研究者在中國云南省1個馬蹄蝠棲息洞穴中對SL-CoVs進行了5年的持續監測，發現了11個新的SL-CoV毒株，這些新毒株在S基因，ORF3和ORF8上具有多樣性。細胞學實驗表明，11個新毒株中有3個毒株能夠使用人類ACE2作為受體，且其S蛋白序列也各不相同[30]。

這項發現為認識SARS-CoV的起源和演變提供了新的見解，同時也警示人們，未來出現類似SARS的疾病的可能性。由于蝙蝠群落中存在基因池豐富的SL-CoVs，科學界普遍認為，由蝙蝠傳播的CoVs很可能重新出現，導致下一次疾病暴發，而中國可能是下一個暴發地。

3 COVID-19

3.1疫情初始 2019年12月下旬，湖北武漢多家醫療機構報告，發現不明原因肺炎患者。2019年12月27日，武漢1家醫院收治了3名重癥肺炎患者。患者甲為49歲婦女，乙為61歲男子，丙為32歲男子。臨床資料顯示，患者甲無潛在慢性疾病，報告發熱 (體溫37 ℃到38 ℃) ，咳嗽，胸部不適，發病4天后，咳嗽和胸部不適惡化，但發燒減退。甲的職業是海鮮批發市場的零售商。患者乙最初于2019年12月20日報告發熱和咳嗽，呼吸窘迫在發病7天后出現，并在接下來的2 d內惡化，流行病調查顯示，乙經常光顧海鮮批發市場。患者甲和丙于2020年1月16日康復出院，患者乙于2020年1月9日死亡[31]。

3.2分子生物學調查 2019年12月30日，武漢金銀潭醫院采集了患者的支氣管肺泡灌洗液，并進行檢測，未發現HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1等病毒。通過聯合Illumina 和nanopore 測序技術，實驗人員在一個樣本中發現了1株與蝙蝠SL-CoV(bat-SL-CoVZC45, MG772933.1)同源性達85%的新病毒序列。該病毒隨后被成功分離并命名為2019-nCoV。經檢測，3名患者均為2019-nCoV陽性。序列分析顯示，從患者支氣管肺泡灌洗液中得到的兩個近乎全長的冠狀病毒序列與先前公布的蝙蝠SL-CoV(SL-CoVZC45，MG772933.1)具有86.9%的同源性。進化樹分析顯示，3名患者的2019-nCoV基因組聚集在一起，顯示出典型的β冠狀病毒組織結構[31]。

隨后的研究又陸續得到6個幾乎相同的新型冠狀病毒基因組，研究人員選取WH-human_1基因組作為代表與SARS-CoV 和 MERS-CoV進行比對發現，其與SARS-CoV基因組的序列同源性更高。WH-human_1與SARSCoV_Tor2之間的序列差異主要集中于ORF1a和S蛋白基因，WH-human_1與中東呼吸綜合征(MERS-CoV)的序列同源性較差。譜系分析顯示，蝙蝠可能是武漢CoV的原生宿主，同時，還可能存在從蝙蝠傳播到人類的中間宿主。基于武漢CoV在遺傳譜系中的獨特位置，它很可能與SARS或SARS樣冠狀病毒有共同祖先，但由于其進化過程中發生的頻繁的重組事件，導致其譜系路徑變得模糊。

總體而言，2019-nCoV和SARS-CoV 之間存在較大的遺傳學距離，這種距離在對比MERS-CoV時更為明顯[32]。同源重組是生物進化的重要力量，其發生在許多病毒中，包括登革熱病毒、人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和經典豬瘟病毒等[33-37]。研究發現，發生在2019-nCoV上21 500～24 000 bp 的同源重組源于蝙蝠-冠狀病毒和1種未知病毒的結合，而這種在S基因蛋白上的重組可能是促進2019-nCoV跨物種傳播到人類的關鍵[38]。

3.3病毒感染機制分析 由于2019-nCoV與SARS-CoV和MERS-COV的遺傳學距離較遠，那么2019-nCoV是采用與SARS-CoV或MERS-CoV相同的跨物種傳播機制，還是涉及一種新的、不同的傳播機制呢？如前所述，冠狀病毒的S蛋白分為兩個功能單元，S1和S2，S1 通過與受體結合來促進病毒感染宿主。S1包含兩個域，N 終端域和 C-終端 RBD 域(直接與宿主受體作用)。盡管2019-nCoV與SARS-CoV的S蛋白序列同源性較低，但在RBD域卻有幾段與SARS-CoV_Tor2和HP03-GZ01高度同源性的序列。先前的研究指出，SARS-CoV中S蛋白的442、472、479、487和491氨基酸殘基參與組成受體界面復合結構，對SARS-CoV的跨物種和人際傳播至關重要，而2019-nCoV中 S蛋白的RBD域高度保守，以上5個關鍵位點僅保留了Tyr491，但令人驚奇是，盡管其442、472、479和487位置的氨基酸被替換，其S蛋白的空間結構并未改變。此外，2019-nCoV和SARS-CoV 的S蛋白在RBD域的三維結構近乎相同，從而在受體交互界面產生相似的范德華力和靜電特性，因此，2019-nCoV的S蛋白被認為對人類ACE2具有較強的結合親和力，并可能通過S蛋白-ACE2結合途徑在人際間傳播[39]。另一項關于COVID-19蛋白結構的研究也表明，雖然其S蛋白受體結合域關鍵殘基與SARS-CoV不同，但其與人類ACE2作用時，卻仍能產生類似于SARS-CoV與人類ACE2結合時的空間結構與親和力[40]。

為進一步證實COVID-19是否通過ACE2途徑感染人類，中國武漢病毒研究所的人員開展了病毒感染實驗，使用表達和不表達ACE2蛋白的細胞進行病毒轉染實驗，結果顯示，COVID-19僅可以進入表達人類、果子貍、豬和中華菊頭蝠ACE2的赫拉細胞，從而進一步證實了COVID-19是通過ACE2途徑感染人類[41]。通過晶體結構分析發現，COVID-19 RBD區域與ACE2受體的整體結合模式與SARS-CoV RBD幾乎相同，COVID-19中結合ACE2的氨基酸殘基或高度保守，或與SARS-CoV RBD中殘基具有相似的側鏈特性，這種結構和序列上的相似性提示COVID-19和SARS-CoV RBD之間存在融合進化現象[42]。此外，值得注意的是，近期的研究顯示，不同于早期病例體內發現的病毒序列，后期二代病例體內的COVID-19在開放閱讀區1ab、7a、8及S蛋白編碼區有17個非同義突變，提示這些位點的突變可能增加了病毒人際間傳播的能力[43-44]。后續的研究應持續關注病毒變異的情況，及時掌握其適應人類ACE2受體的進化方向。

在關注ACE2途徑的同時，需要注意的是，冠狀病毒跨物種或人際傳播的風險也受宿主免疫反應、病毒復制效率、病毒突變率等許多其他因素的影響。

3.4自然宿主相關研究 最近一項基于病毒全基因組數據分析的研究對COVID-19的進化來源進行分析，通過對比96個COVID-19病毒序列全基因組，發現120個變異位點并得到58種單倍型，為了解病毒進化路徑提供了參考[45]。然而，由于上述研究的樣本量較小，為更準的預測病毒來源和進化路徑，還需要對更多樣本進行測序，掌握更多地區和時間段發病病例的病毒基因組序列。最近的一項研究發現，蝙蝠冠狀病毒(Bat SARSr-CoV RaTG13)與COVID-19的基因序列同源性高達96%，研究者據此推斷蝙蝠可能是COVID-19的原生宿主[46]。然而，蝙蝠攜帶的CoVs很少直接感染人類，所以蝙蝠不太可能是導致該流行病的直接原因。最新的一項研究調查了2019年3月-12月被海關和廣東林業廳收繳的走私馬來穿山甲 (Manis javanica)，其體內分離的冠狀病毒在E、M、N和S蛋白區域與COVID-19分別具有100%、98.2%、96.7%和90.4%的氨基酸同源性，值得注意的是，穿山甲冠狀病毒的S蛋白的受體結合域與COVID-19的受體結合域幾乎相同，僅存在一個氨基酸差異，此外，晶體結構分析顯示，穿山甲冠狀病毒與穿山甲ACE2有一定親和力[47]。然而，還需要通過感染實驗進一步證實穿山甲體內發現的冠狀病毒是否采用ACE2受體作為感染途徑。此外，基于現有基因組數據的研究提示，COVID-19可能源于穿山甲-CoV的病毒與蝙蝠-CoV-RaTG13病毒的重組[48-49]。

4 啟 示

自2003年以來，冠狀病毒第3次在人類歷史上引發了嚴重疾病流行。根據最新的研究顯示，2019-nCoV 可在用于培養SARS-CoV和MERS-CoV的相同細胞中繁殖，值得注意的是，2019-nCoV在人類呼吸道上皮細胞中生長更好，這點與SARS-CoV或MERS-CoV不同。相比之下，MERS-CoV自發現以來，序列并沒有發生實質性變異，其感染人類的能力也未見提高。所以，2019-nCoV 可能更像 SARS-CoV，通過增強與人類ACE2 的結合力而適應人類宿主。為了及時掌握病毒的變異情況，必須盡可能多的獲取不同時間、地理位置發病患者病毒分離物的序列，動態評估病毒變異的程度，判別這些突變是否朝著適應人類宿主的方向發展。

盡快確定病毒的來源是另一個急需解決的問題。冠狀病毒可感染哺乳動物、鳥類和爬行動物，包括人類、豬、牛、馬、駱駝、貓、狗、嚙齒動物、鳥類、蝙蝠、兔子、白鼬、水貂、蛇等[50-52]。然而，目前還未從任何野生動物中發現2019-nCoV。近年來，分子生物學領域技術迅猛發展，不同于“非典”疫情時期，現在的基因測序技術可以在短時間內得到病毒的全基因組數據，在未知病原體檢測方面發揮了重要作用。盡管如此，截至目前，人們尚未發現2019-nCoV的原始宿主，病毒進化的速度似乎又一次領先了科學的發展速度。冠狀病毒在自然界中的宿主廣泛，而其本身又變異頻繁，販賣野生動物的行為不僅為病毒提供了多物種的基因資源，同時也為病毒探索如何感染人類提供了實驗機會。病毒在挑戰人類科學水平和生存意志力的同時，也啟示人們需要對自己的行為進行反思。