新型冠狀病毒肺炎確診病例糞便標本的病毒核酸檢測

吳冰珊，俞婷婷，黃枝妙，陳宏彬，陳 煒，張炎華，游麗斌，朱 穎，吳晶晶，鄢育青，翁育偉

2020年2月11日，世界衛生組織將新型冠狀病毒感染引起的肺炎命名為“COVID-19”。由于人員流動，福建省各地市也相繼發現了輸入性確診病例。目前認為本病的傳染源主要是COVID-19患者，經呼吸道飛沫傳播是主要的傳播途徑。Holshue等首次報道在確診病例的上呼吸道和糞便中檢出2019-nCoV[1]，對于2019-nCoV是否通過糞便污染水、食物和環境直接或間接接觸造成人傳人感染，需要進一步科學驗證。筆者對36例確診病例的糞便標本/肛拭子標本進行病原體檢測，初步探討2019-nCoV經消化道感染的可能性。

1 材料與方法

1.1標本來源 本中心在廈門、寧德、三明、福州、南平、莆田、漳州等地共采集36例COVID-19確診病例標本，包括31份糞便標本和5份肛拭子標本。為維持病毒的最佳存活條件，送檢標本被分裝于若干管，取其中一管以生理鹽水處理成10%懸液，高速離心(8 000 r/min，5 min)后取懸液進行檢測，其余-20 ℃凍存以待進一步分析。

1.2病毒RNA提取 參照病毒DNA/RNA提取試劑盒(天隆,西安)說明書進行操作，吸取離心后的標本懸液上清200 μL，加入到預混的深孔板，于生物安全柜靜置10 min后，置全自動病毒核酸提取儀NP968-S(天隆,西安)提取病毒核酸。程序運行結束后，吸取核酸轉置于1.5 mL離心管，直接用于實時熒光RT-PCR或-20 ℃冷凍。

1.3基因片段擴增 根據中國CDC推薦的引物和探針擴增2019-nCoV病毒的ORF1ab和核殼蛋白N基因[2]，使用AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit(AB, AM1005)在ABI7500熒光檢測儀進行檢測，逆轉錄條件包括45 ℃ 10 min及95 ℃ 10 min滅活；PCR擴增條件為40個擴增循環，包括95 ℃15 s和60 ℃ 60 s收集熒光，檢測通道Ct值<37判斷為陽性。

1.4統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行數據處理，采用Fisher’s確切概率法進行率的比較，P<0.05表示有統計學意義。

2 結 果

2.1檢測概況 36例COVID-19確診病例中有 20 例的標本檢出 2019-nCoV，陽性率為 55.56%，其中包括男性22例、女性14例，檢出率分別為54.55%(12/22)和57.14%(8/14)。病例年齡分布于17～86歲之間，平均為48.75歲。性別和年齡組間陽性檢出率均無統計學差異(P=1.00)。

2.2不同臨床分型病例的檢測結果 根據36例患者臨床表現的輕重不同進行臨床分型，其中危重癥病例和重癥病例標本陽性率均為 66.67%(2/3、6/9)、普通肺炎病例陽性率為62.50%(10/16)、輕癥肺炎病例陽性率為25.00%(2/8),各臨床類型組間病毒檢出率無統計學差異(P=0.303)。根據病例來源，36例患者分為散發病例和聚集性病例，兩種病例來源的2019-nCoV檢出率分別為42.86%(6/14)和63.64%(14/22)，二者之間無統計學差異(P=0.307)。

2.3采樣時間和核酸載量分布 36例患者標本采樣時間與發病時間間隔天數平均為9.89 d。20例糞便標本檢出 2019-nCoV 核酸的陽性患者，從發病到采樣的中位時間為9 d(3～17 d),16 例未檢出 2019-nCoV 核酸的患者從發病到采樣的中位時間為 10 d(5～16 d)，兩者無明顯差異。2019-nCoV核酸陽性標本的核酸載量有較大范圍分布，2019-nCoV ORF1ab基因 Ct 值從22至 29之間的標本為7例(7/20,占35%)，Ct 值大于30的為13例(13/20,占 65%)； 2019-nCoV N基因Ct 值從 21至30之間的標本為6例(6/20,占30%)，Ct值大于30的為14例(14/20,占 20%)。標本采樣時間和核酸載量沒有明顯相關性。

2.4標本類型 36份標本來自于36個COVID-19確診病例，其中4例臨床上有腹瀉癥狀，包括5份肛拭子標本和31份糞便標本，分別檢出陽性標本2份(2/5，40%)和18份(18/31，58.06%)，陽性檢出率無統計學差異(P=0.637)。

3 討 論

2019-nCoV被確定為引起2019年中國COVID-19暴發的病原體，并成為國際關注的突發公共衛生事件[3]。病毒全基因組序列信息分析提示2019-nCoV序列之間高度相似(>99%)，與SARS病毒、MERS病毒進化上同屬于β-冠狀病毒屬，但基因特征與SARS病毒和MERS病毒有明顯區別，與來自云南的中華菊頭蝠的冠狀病毒(Gisaid EPI_ISL_402131)最接近，高達96.2%的相似性，因此多數學者認為證實了2019-nCoV病毒應源于動物源性的觀點[4-6]。一般認為冠狀病毒通過感染作為中間宿主的野生動物，并可能通過基因重組和突變擴大遺傳多樣性及增強對人類致病能力[7]，然而，2019-nCoV如何突破物種界限引起人類感染，需通過進一步深入研究加以闡明。

現有臨床資料提示2019-nCoV致病性雖然低于SARS和MERS病毒，但仍能導致嚴重的呼吸系統疾病，甚至引起死亡病例，家庭聚集病例和醫務工作者出現感染的報告明確指出2019-nCoV具有人際傳播能力[8-9]。目前資料表明2019-nCoV傳播途徑主要是呼吸道飛沫傳播和接觸傳播，氣溶膠和消化道傳播途徑尚未明確，具體傳播能力和方式仍然存在爭議，因此對提供有效的控制措施存在不確定性。既往研究認為冠狀病毒能存在于雪貂等動物糞便但不引起動物發病[10]，推測新發2019-nCoV類似于其他感染人的冠狀病毒可能首先在人呼吸道和腸道的上皮細胞進行感染復制，進而導致細胞病變[11]，但2019-nCoV致病機制的分子基礎尚需進行深入的研究得以闡明。我們的結果初步表明55.56%的確診患者可排出2019-nCoV，證實COVID-19確診患者同SARS病人一樣除了以呼吸道、密切接觸患者呼吸道分泌物傳播外，也可能通過潛在的糞-口途徑傳播，包括糞便標本污染的手、食物、水等，通過侵入口腔、呼吸道粘膜和眼結膜等侵入方式導致感染。CHEN等認為COVID-19患者與SRAS感染者不同，腸道癥狀如腹瀉比例較低[12]，但鑒于2019-nCoV和SARS-CoV高度相似，推測2019-nCoV也有可能造成病毒血癥和影響呼吸道以外的組織器官。本研究確診病例中具有腹瀉癥狀者僅占11.11%，糞便和肛拭子標本的2019-nCoV病毒檢出率無統計學差異，臨床上可僅檢測其中一種標本，以減少檢測工作量。

本研究提示COVID-19確診病例腸道標本的2019-nCoV陽性檢出率在臨床分型、性別、年齡和標本類型等各變量組間均無統計學差異，標本采樣時間和病毒核酸載量沒有明顯相關性。由于僅局限于36例確診病例，樣本量較小，需要擴大樣本量進一步觀察。同時由于沒有在同一患者同時采集糞便和肛拭子標本及發病時間多次采樣，影響病毒陽性檢出率的比較。人體胃酸通常對包膜病毒有殺滅作用，暫還不能確定2019-nCoV是否能通過糞口途徑由胃進入腸道導致感染引起暴發傳播。鑒于2019-nCoV疫情目前的資料較少，需要繼續開展對COVID-19病例糞便排毒和呼吸道排毒的監測，動態跟蹤研究當患者呼吸道標本病毒核酸陰性時，比對糞便標本是否停止排毒，進一步評估了解病毒和傳播的特征，以完善風險評估和采取控制措施遏制病毒的傳播。