組蛋白脫乙酰酶6脫乙酰催化域的底物蛋白及功能*

張 斌， 見文成， 蔣 凡

（山東大學齊魯醫學院 1基礎醫學院藥理學系，2齊魯醫院放射科，3教育部和國家衛計委心血管重構和功能研究重點實驗室，山東濟南250012）

蛋白質的乙酰化修飾是蛋白功能調節的重要機制，影響細胞增殖、遷移、凋亡等多方面功能。靶蛋白的乙酰化狀態受組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylases，HDACs）和組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferases，HATs）的共同調節。乙酰化和脫乙酰化狀態失衡可影響細胞正常的生命活動。HDACs通過對組蛋白及某些非組蛋白的賴氨酸（lysine，Lys）殘基脫乙酰化修飾，調控細胞的病理生理過程，參與多種疾病的發生發展。目前，在哺乳動物細胞中已發現了 18 種 HDACs，根據特性分為 4 類:I 類包括HDAC1、2、3 和8，主要使組蛋白脫乙酰化；II 類包括HDAC4、5、6、7、9 和10，與非組蛋白脫乙酰作用密切相關，被進一步分為 IIa（HDAC4、5、7、9）和 IIb（HDAC6、10）2 個亞類；III 類包括SIRT1～7，主要作用于非組蛋白底物；IV 類包括HDAC11。大量研究表明，HDACs 各亞型在不同疾病狀態下發揮不同功能，因此，明確HDACs 亞型的特點對于了解疾病的發生機制及特異性藥物的研發具有重要意義。

HDAC6 屬于IIb 類HDACs，是家族中最大的亞型，含1 215個氨基酸殘基，分子量約131 kD，酶活性依賴 Zn2+。HDAC6 結構獨特［1］，包含 1 個核定位信號區（nuclear localization signal，NLS）、2 個保守的富含亮氨酸的核輸出信號區（nuclear export signal，NES）NES1 和NES2、8 個連續的含絲氨酸-谷氨酸的十四肽（Ser-Glu-containing tetradecapeptide，SE14）重復序列、2 個串聯的脫乙酰催化域（deacetylase catalytic domain，DD）DD1 和DD2、1 個鋅指泛素結合結構域（zinc-finger ubiquitin-binding domain，ZnF-UBP）及1個動力蛋白馬達結合域（dynein motor binding domain，DMB）。雖然結構中存在NLS，但是在NES 和SE14的作用下，HDAC6主要定位于胞漿中。DD1和DD2 是HDAC6 的酶活性區域，均有使底物蛋白脫乙酰化的活性，其中DD2 的功能特征較為明確，是HDAC6 選擇性抑制劑的作用靶位［2］。ZnF-UBP 和DMB 是HDAC6的非酶活性區域，可以與泛素化的錯誤折疊蛋白結合，在動力蛋白作用下沿微管至聚集體，促進包涵體形成，經自噬系統清除毒性蛋白。

基于HDAC6 的結構特征，已有多個HDAC6 抑制劑被發現。這些抑制劑的化學結構包含帽基團（cap group）、連接區（linker）及Zn2+結合基團（zincbinding group）3 個部分。帽基團是HDAC6 抑制劑的表面識別區，與HDAC6 酶活性區域的底物結合區相結合，Zn2+結合基團螯合酶活性部位的Zn2+，抑制酶的活化。一些異羥肟酸類小分子化合物雖無帽基團，但其α 位的sp2雜化碳結構也可有效抑制HDAC6的酶活性［3］。目前HDAC6 抑制劑僅作用于HDAC6的酶活性區域，抑制其脫乙酰活性，而對ZnF-UBP 和DMB 等非酶活性區域無顯著影響，這與HDAC6基因的沉默或敲除是不同的，后者影響到了HDAC6 的所有功能［2］。近年來，HDAC6 抑制劑在惡性腫瘤、神經退行性疾病、心血管疾病等疾病治療方面均顯示出廣闊的應用前景，表明HDAC6 的脫乙酰活性及其底物蛋白的乙酰化穩態對機體病理生理功能的調節至關重要。HDAC6 已被證實可影響多個底物蛋白的乙酰化水平，包括微管蛋白（tubulin）、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）、皮層肌動蛋白結合蛋白（cortical actin-binding protein，cortactin）等。本文將對HDAC6 的脫乙酰底物及其功能的研究進展進行綜述。

1 tubulin

tubulin 是 HDAC6 的主要底物蛋白，是第 1 個得到鑒定的可被乙酰化調節的胞漿蛋白，從而改變了傳統的觀點——即乙酰化功能只是修飾細胞核內組蛋白而影響轉錄。tubulin 包含兩種類型:α-tubulin和β-tubulin，二者結合形成二聚體作為微管組裝的亞基。在真核生物中，微管是細胞骨架的主要成分，對于維持細胞形狀、物質轉運、細胞運動、DNA 分離等都起到了不可或缺的作用。在微管形成過程中，tubulin 的翻譯后修飾，如乙酰化、磷酸化、泛素化等，對于微管的性能及細胞功能的調節都至關重要。tubulin 乙酰化水平受 α-tubulin 乙酰轉移酶 1（α-tubulin acetyltransferase 1，ATAT1）和 HDAC6 的調控，維持動態平衡。乙酰化的tubulin有助于維持微管的穩定性，是微管穩定的標志；HDAC6 過表達則可使tubulin 脫乙酰化，從而降低微管穩定性，增加細胞運動［4］。tubulin 乙酰化在多種細胞生命活動中均發揮作用，例如可以使細胞免受H2O2、KCl、紫外輻射等刺激誘導的細胞死亡，調控應激反應［5-6］。自噬體與溶酶體的融合也需要乙酰化的tubulin 來參與［7］。研究人員還發現小鼠腦中乙酰化tubulin 富集，tubulin 乙酰化缺失則可致腦發育異常、智力障礙，提示tubulin乙酰化在維持學習記憶等高級神經活動中具有重要作用［8］。因此，作為調控tubulin 乙酰化水平的關鍵酶，HDAC6的作用也就尤為重要。

研究表明，tubulin 乙酰化的失衡與神經系統疾病、腫瘤、心臟病等多種疾病密切關聯。在一項關于進行性神經性腓骨肌萎縮癥的研究中，實驗人員發現模型小鼠出現tubulin脫乙酰化、軸突運輸缺陷，而HDAC6 抑制劑可以減輕這種癥狀［9］。而且，在帕金森病［10］、肌萎縮側索硬化癥［11］、阿爾茨海默病［12］等中樞神經退行性疾病中，抑制HDAC6 所發揮的保護作用都與增加tubulin 乙酰化、改善軸突運輸有關。tubulin 乙酰化的狀態還關系著多種腫瘤的發展轉歸。例如，tubulin 乙酰化是頭頸部鱗狀細胞癌的預后標志［13］，可抑制腫瘤細胞上皮-間充質轉化，提高微管穩定性，從而減少癌細胞的侵襲和轉移［14］。在原發性乳腺腫瘤中，tubulin 乙酰化可增加疾病進展或死亡的風險［15］。此外，tubulin 乙酰化狀態與心臟疾病亦有關，脫乙酰化可促進蛋白質毒性，誘發小鼠心肌病，而HDAC6抑制劑則可減緩這種病理過程［16］。

2 HSP90

HSPs 是一類高度保守的分子伴侶，是第2 種被鑒定的HDAC6 底物蛋白，當宿主受到高溫、缺氧、病原體等刺激時 HSPs 合成增加［17］。HSPs 的主要功能包括蛋白質激活、分子復合物的組裝和解聚、與泛素-蛋白酶體協同調節錯誤折疊蛋白的降解等。按照分子量的不同，HSPs分為6類，其中HSP90的含量尤為豐富，以二聚體形式存在。作為分子伴侶，HSP90 的活性依賴ATP，以分子伴侶復合物（含多種輔助分子伴侶）的形式與數以千計的蛋白質產生相互作用，廣泛參與細胞生命活動。HSP90 的功能受HDAC6 酶活性的調節［18］。脫乙酰化的 HSP90 驅動客戶蛋白（client protein）復合體的形成，而HDAC6抑制劑增加HSP90乙酰化，降低其分子伴侶活性，使其結合ATP 的能力降低，與客戶蛋白及輔助分子伴侶的相互作用減弱，從而抑制客戶蛋白的成熟［19］。客戶蛋白，也稱為顧客蛋白，是一系列底物蛋白（substrate protein），廣泛參與調控細胞存活、增殖和凋亡，在細胞信號轉導及穩態維持方面發揮重要作用。目前已有200 多個HSP90 的客戶蛋白得到確認。研究表明，HSP90 可調控血管形成因子如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及抗凋亡因子如Akt的穩定性，脫乙酰化的HSP90可使這些蛋白的穩定性增強，促進血管形成和細胞存活［20-21］。雄激素受體、糖皮質激素受體等類固醇激素受體的功能也受HSP90 乙酰化狀態的影響，乙酰化的HSP90 引起共伴侶分子的解離，使配體與激素受體的結合減少，破壞受體的核轉位，而脫乙酰化的HSP90 則促進受體的成熟［22-23］。HSP90 乙酰化還可增加調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）的免疫抑制活性，維持免疫穩態，反之則易引起自身免疫病、移植排斥的發生［24］。此外，HSP90 乙酰化可限制甲型流感病毒入核，抑制病毒復制而干擾其生命周期［25］。缺氧誘導因子 1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）也受HSP90 乙酰化狀態的調節，高乙酰化可降低HIF-1α的穩定性［26］。

乙酰化削弱了HSP90 與客戶蛋白的相互作用，極大的影響了客戶蛋白的生物活性。因此，HSP90的功能與多種疾病的發生發展息息相關。HSP90 的客戶蛋白包括多種致癌蛋白（如DNA 甲基轉移酶1）和抗凋亡蛋白（如Akt），HSP90 與這些蛋白結合形成復合體，防止它們降解，從而促進腫瘤發生。而HDAC6 抑制劑增加HSP90 乙酰化，使復合體解離，DNA 甲基轉移酶1 等在泛素-蛋白酶體的作用下降解，引起細胞凋亡，從而在癌癥治療中發揮有益作用［27］。此外，HSP90 乙酰化狀態在其他疾病中的作用也有報道:Gaucher 病是一種常染色體隱性遺傳病，患者葡萄糖腦苷脂酶（glucocerebrosidase，GCase）活性缺失，造成葡萄糖腦苷脂在巨噬細胞溶酶體中貯積，受累組織器官出現病變；GCase 可被HSP90 識別結合并通過相關途徑降解，而乙酰化的HSP90 與GCase 的結合力降低使GCase 的壽命延長，從而利于其活性的發揮，改善葡萄糖腦苷脂的代謝［28］。

3 cortactin

肌動蛋白（actin）是細胞骨架微絲的主要成分，以肌動蛋白單體（G-actin）和由單體組裝而成的纖維狀肌動蛋白（F-actin）兩種形式存在。除actin 外，還有其他蛋白參與微絲的結構功能，cortactin 就是一種微絲肌動蛋白結合蛋白，通過調控微絲的聚合參與多種細胞活動，如突觸形成、囊泡運輸、細胞黏附、細胞侵襲、細胞遷移、細胞分裂等。cortactin 的功能受乙酰化等翻譯后修飾的調節。在HDAC6 作用下，cortactin 脫乙酰化可增加其與F-actin的相互作用，從而促進F-actin 的聚合和纖毛吸收，導致細胞纖毛縮短、丟失［29］。cortactin 的脫乙酰化有助于與 actin 的結合，促使細胞形成偽足，增加基質金屬蛋白酶的胞膜輸送，在腫瘤細胞的侵襲和遷移中具有重要意義［30-31］。脫乙酰化的cortactin 對于內皮細胞的遷移和發芽也是必不可少的［32］。Yan 等［33］在一項巨噬細胞的研究中發現，在炎癥信號刺激下，HDAC6 可轉移到細胞外圍，使cortactin 和tubulin 脫乙酰化，從而增強actin 的裝配及微管運動，這些細胞骨架動力學的變化進而促進了巨噬細胞的浸潤和吞噬反應；而HDAC6 缺乏時，巨噬細胞對炎癥信號則變得不敏感。

cortactin 的脫乙酰化調節在疾病發生發展中的作用已有諸多報道。纖毛作為細胞附屬物，在感知和傳導環境信號、組織發育、穩態維持方面均發揮作用。cortactin 的脫乙酰化導致纖毛功能異常，與Bardet-Biedl 綜合征、多囊腎、慢性阻塞性肺氣腫等纖毛病變有關，而HDAC6 抑制劑則可減輕纖毛功能的損失［34］。cortactin 脫乙酰化可激活內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），增強內皮細胞NO 生物活性，保護血管功能，從而對抗動脈粥樣硬化病變［35］。cortactin 的乙酰化則可造成促性腺激素釋放激素表達神經元遷移受損，導致性機能減退［36］。此外，脫乙酰化的cortactin還可促進白血病淋巴細胞的浸潤遷移，為白血病的診治開辟了新的思路［37］。

4 過氧化氧化還原蛋白（peroxiredoxin，Prx）

Prx 是一類抗氧化蛋白，廣泛存在于生物體中，哺乳動物的Prx包括Prx1、2、3、4、5、6，在消除活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的過程中具有重要作用。研究表明，Prx亞型在阿爾茨海默病、皮克病、帕金森病等疾病中存在異常表達，其磷酸化、亞硝基化等改變均造成酶活性的喪失。近年來Prx 的乙酰化修飾受到愈來愈多的關注。Parmigiani 等［38］在實驗中發現Prx1及Prx2是HDAC6的特異性底物，乙酰化Prx1 及Prx2 的抗氧化作用顯著增強，可提高細胞存活率，而脫乙酰化Prx1 及Prx2 的抗氧化能力大大降低，細胞死亡率增加，提示Prx1及Prx2的乙酰化在抗氧化應激損傷中具有重要作用。

一項關于阿爾茨海默病的研究顯示，病人腦組織中Prx1 乙酰化水平降低，原代培養的海馬神經元在 Aβ 作用下 Prx1 乙酰化水平也降低，而 HDAC6 抑制劑可以增加Prx1乙酰化，繼而減少ROS的生成，改善線粒體軸突運輸，減輕病理損傷［39］。Janina等［40］在進行遺傳性失明的研究中發現，Prx1 的過氧化物還原活性與其乙酰化程度相關，HDAC6 抑制劑tubastatin A 可以逆轉Prx1 的脫乙酰化，阻止酶活性的滅活，從而保護感光細胞，在斑馬魚模型中具有顯著的視覺保護功能。Jian 等［41］在6-羥基多巴導致的帕金森病動物模型中也發現小鼠紋狀體中Prx1及Prx2乙酰化水平降低，抗氧化作用減弱，ROS 消除受抑，而HDAC6 抑制劑可以明顯增加其乙酰化，減輕氧化損傷及多巴胺能神經變性。另有研究報道，在HDAC6 抑制劑的作用下，Prx1 乙酰化還可以減輕心肌缺血再灌注損傷［42］。這些結果均表明Prx1和Prx2的乙酰化狀態可以調控多種疾病的病理過程。

5 Ku70

Ku70 是Ku 蛋白的亞單位之一，分子量約為70 kD，作為一種DNA末端連接蛋白，在DNA復制、DNA修復、轉錄調控、端粒結構的維持等細胞活動中發揮重要作用。Ku70 在乳腺癌、宮頸癌等腫瘤組織中高表達，與惡性腫瘤的發生發展密切相關。研究表明，Ku70 的功能受HDAC6 調節，乙酰化狀態決定其在DNA 修復中的作用。Chaudhary 等［43］報道，核基質結合區結合蛋白Smar1 通過HDAC6 介導Ku70 脫乙酰化，并使其向DNA 雙鏈斷裂位置募集，在電離輻射誘導的DNA 損傷中促進DNA 的有效修復，減少細胞凋亡。Boucherat等［44］在一項肺動脈高壓的研究中發現低乙酰化的Ku70可以阻止促凋亡蛋白Bax向線粒體易位，抑制凋亡，促進血管平滑肌細胞增殖和血管重構，加重肺動脈高壓的進展，而HDAC6 抑制劑可提高Ku70乙酰化水平，引起Bax易位，促進線粒體膜去極化及細胞凋亡，從而減輕肺動脈高壓的癥狀。Ku70 還具有去泛素酶活性，在胞漿內可與泛素化的Bax或抗凋亡蛋白c-FLIP等結合形成復合體，阻止它們被蛋白酶體降解，在HDAC6 抑制劑的作用下，Ku70 乙酰化水平升高，復合體解離，導致Bax 激活、c-FLIP 降解，從而誘導細胞凋亡，在殺傷腫瘤細胞過程中發揮有效作用［45］。

6 其他

HDAC6 的脫乙酰催化底物還有 p53、Akt、βcatenin 等。p53 是一種抑癌蛋白，具有轉錄因子活性，參與調控細胞穩態，抗腫瘤形成。p53 羧基末端Lys 殘基（Lys120、Lys164、Lys370、Lys372、Lys373、Lys381、Lys382和Lys386）的乙酰化修飾是其行使正常生理功能的重要機制［46］。脫乙酰化p53 的轉錄因子活性受到抑制，從而促進細胞生長，抑制凋亡，誘發腫瘤；而乙酰化 p53 的轉錄活性增強，發揮抗腫瘤作用［47］。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調節細胞增殖、基因轉錄、遷移、葡萄糖代謝等活動。Iaconelli 等［48］研究發現，在人神經前體細胞（human neural progenitor cells，NPCs）中，Akt 激酶活性受 HDAC6 的調控，二者相互作用，使Akt 結構域的Lys163和Lys377脫乙酰化，而在HDAC6 抑制劑的作用下，Akt乙酰化水平升高，與三磷酸肌醇結合減少，Akt激酶活性減弱，從而降低靶蛋白磷酸化水平，調節神經元的分化。βcatenin 是鈣黏蛋白復合體的亞基，主要位于胞膜，在病理生理因素的誘導下可以從復合體中脫離進入胞核，參與基因表達，調節細胞增殖、分化及凋亡。βcatenin 的核轉位是Wnt 信號通路活化的一個標志，與多種癌癥相關［49］。研究表明，乙酰化 β-catenin 的核轉位受到抑制，影響其對基因表達的調控作用。Li 等［50］報道，在表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）的刺激下，β-catenin 的 Lys49在 HDAC6 的作用下脫乙酰化，從而促進β-catenin 核轉位，使c-Myc 表達增加；而 HDAC6 失活使 β-catenin 乙酰化水平升高，能夠阻斷EGF誘導的β-catenin核轉位，繼而降低c-Myc的表達，抑制腫瘤細胞的增殖。

7 小結

綜上所述，HDAC6 脫乙酰作用的研究已取得了一些成果，但是如何恰當地進行干預仍是亟待解決的問題。例如，HDAC6 底物眾多，各底物均具有數目不等的Lys 殘基，如何更精準地確定脫乙酰位點；DD1 和DD2 的底物是否具有差異；是否還有其他尚未發現的底物蛋白；影響脫乙酰活性的信號通路有哪些，等等。總之，HDAC6 脫乙酰作用對于機體病理生理功能的調節已引起學界的廣泛關注，深入研究其生物學機制，明確底物調控的細節和臨床意義，將有助于發展圍繞HDAC6 脫乙酰催化作用的治療策略。