內毒素的生物學特性及其對非洲豬瘟流行下豬只復養的影響

（1.江西省農業科學院畜牧獸醫研究所，江西 南昌 330200；2.江西中成人藥業有限公司，江西 進賢 331700）

在非洲豬瘟（African swine fever, ASF）流行的嚴峻形勢下，要成功復養，除做好非洲豬瘟生物防控措施外，其中重要的一點就是搞好豬場內毒素（Endotoxin, ET）的凈化工作。早在百余年前，人們就認識到革蘭氏陰性菌（Gram-negative bacteria, GNB）所釋放出的一種物質能致動物發熱、休克，著名科學家理查德菲佛（Richard Pfeiffe）首次將此物質冠名為“內毒素”。后來的研究證明，這種物質的化學本質就是脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）， 故 ET 又 叫 LPS[1]。 目 前，有關ET的生物活性，在人上研究較多且較深入。有關報道多是ET進入人體血液所致的內毒素血癥（Endotoxemia,ETM），以及繼發的其他疾病。而ET對畜禽的影響，尤其是對豬只健康的影響的報道較少。

1 內毒素（ET）的生物學特性

1.1 內毒素是由革蘭氏陰性菌產生并存在于菌體內的一種毒素

ET是一種由GNB產生并存在于菌體內的潛在毒素[1]，其化學本質乃GNB細胞壁中的LPS。這種毒素的潛在毒性，在正常狀態下，ET作為構成GNB細胞壁的組分，不會釋放出來[1]。只有當GNB死亡自溶，或人工破壞（如用超聲波處理）GNB菌體，或將GNB黏附到其他細胞上時，ET的主要活性（毒性）組分LPS就會隨細菌外膜小泡囊（Outer membrance vesicles,OMVs）釋放出來，對動物機體表現出毒性[2-3]。實驗室常用超聲波處理GNB或反復凍融GNB的方法來制備試驗所需的ET。ET的化學組成復雜，它是一種由“磷脂 多糖 蛋白質”組成并具有化學異源性的復合物。不同來源的ET其相對分子質量變化范圍大，從幾千到幾萬（道爾頓）。ET具有親脂與親水的雙親性，能夠在水中形成締合物[4]。因而，進一步加劇了其相對分子質量的變化范圍。

1.2 內毒素隨細菌外膜囊泡釋放

OMVs是一種由細菌細胞外膜形成，普遍存在于GNB以及某些革蘭氏陽性菌中，且包含有多種生物學活性物質，外形多為球形，直徑約為20～250 nm的囊泡狀結構[5]。OMVs由LPS、外膜蛋白、磷脂、DNA及其形成過程中為外膜所包裹的周質成分（Periplasm）等組成，ET隨外膜小泡囊而釋放[6]。

1.3 內毒素刺激 Toll樣受體 4（TLR4）導致炎癥因子（IF）的釋放

1.3.1 Toll樣受體的發現與免疫學意義

1.3.1.1 Toll樣受體的發現

Toll基因是一個決定果蠅背腹側分化的基因，于1980年由Nusslein-Volhard等發現并命名。Toll基因能夠編碼一種被稱為Toll蛋白的跨膜蛋白質（Hashimoto等，1988），其結構與白細胞介素1受體（Interleukin-1 receptor, IL-1R）具有同源性，二者的細胞質部分相似（Gay等，1991）。由于IL-1R是一種存在于哺乳動物中具有天然免疫功能的物質，不由得使人聯想到，Toll蛋白或許與免疫有關[5-6]。

1.3.1.2 Toll樣受體的免疫學意義

據報道，人體中確實存在著Toll樣 受 體（Nomura等，1994）。1996年，Jules A. Hoffmann等首次發現Toll蛋白具有免疫作用。隨著對Toll蛋白免疫功能研究的深入，Toll蛋白新的免疫功能相繼被發現；1997年，Charles Janeway等 發 現有一種后來被命名為Toll樣受體4（Toll-like receptor 4, TLR4）的 Toll樣受體，具有激活與適應性免疫相關的基因的功能。TLR4能夠探測到機體內是否存在著LPS，而且當TLR4因突變而喪失其功能時，試驗小鼠不會對LPS刺激有任何反應（Beutle等，1997）[5-6]。后來的研究者們，利用基因打靶的方式，使小鼠的其他各種TLR蛋白功能喪失的研究中發現，每種TLR蛋白可識別不同類的分子。自此，人們不僅完全揭示了Toll樣受體在免疫學上的意義，而且找到了百余年前就開始探尋的那個受體物質[5-6]。

1.3.2 內毒素激活炎癥因子，引起細胞損傷、死亡

ET的生物學活性極強，作為ET主要活性（毒性）組分的LPS是最早確認的經典致病因子（Pathogenic factor, PF）。是迄今為止研究最深入的病原體相關模式分 子（Pathogen-associated pattern molecular, PAPM）。LPS穩 定、 耐熱，其毒性比外毒素低，在動物機體內部發生作用時沒有組織器官的特異性，不同病原菌產生的ET引起的疾病癥狀基本相同，主要表現在：1）發熱，造成機體體溫升高；2）腹瀉；3）粒細胞減少；4）出血性休克；5）敗血癥；6）彌散性血管內凝血；7）若GNB感染或經靜脈注射提取的ET，會出現如呼吸窘迫綜合征、急性腎衰竭，甚至多器官功能衰竭等嚴重疾病，最終因ET而導致休克死亡[2]。把ET注射到機體內雖可產生一定數量的抗體（特異免疫產物），但這種抗體的作用很弱，不能抵消ET毒性作用。

1.3.3 內毒素激活炎癥因子的信號轉導機制

ET激活炎癥因子（Inflammatory factor, IF）的信號轉導機制為：ET進入機體內，第一，與血液中的內毒素結合蛋白（Endotoxin binding protein, EBP）結合形成ET-EBP復合物；第二，復合物再與單核巨噬細 胞（Mononuclear macrophages）這類髓源性細胞（Myeloid cells）表面 的LPS受 體CD14（Membrane receptor CD14, mCD14）或血液中的可溶性受體CD14（Soluble receptor CD14, sCD14）結 合；第三，在髓樣分化蛋白-2（Myeloid differentiation protein-2, MD-2） 的參與下，激活TLR4信號通路；第四，ET刺激信號沿著激活的TLR4信號通路傳向細胞內，再通過髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88, MyD88）依賴與非依賴這樣兩條途徑，啟動一系列信號級聯反應（Signal cascade reaction, SCR），誘導促炎細胞因子（Proin flammatory cytokine, PIC）的表達，刺激單核細胞、巨噬細胞等合成并釋放IL-1β, IFNγ與TNF-α等高生物活性IF，引發炎癥（紅腫、發熱、疼痛與出血）以及細胞損傷、組織死亡與動物休克。Toll樣受體家族中的TLR4是ET的主要受體。ET在刺激TLR4導致一系列IF釋放的同時，有效地激活了機體的免疫應答。ET/TLR4信號傳導在這一過程中起著極其重要的作用，是炎癥反應及其控制的關鍵點，已成為治療ETM的研究熱點。

2 非洲豬瘟流行下豬場環境中內毒素對豬只的影響

2.1 豬場環境中內毒素對豬只呼吸系統的影響

豬場環境中尤其是空氣中不可避免地存在著ET，這是由豬場空氣中不可避免地存在著的塵埃所決定的。豬場空氣中ET含量的多少取決于空氣中塵埃的含量及其組成（如糞尿、皮屑、飼料、墊草、微生物及其細胞壁組分等）。豬場空氣中ET濃度的高低關系到豬只的健康，尤其是豬呼吸系統的健康。據報道，豬場空氣中ET含量與豬肺炎、胸膜炎的發病率以及新生仔豬的死亡率具有一定的相關性[7]。另據報道，豬場空氣中的ET可誘發豬的中毒性肺炎[8]。也有研究表明，豬舍空氣中的ET與塵埃會造成豬呼吸道功能紊亂，并損傷豬的鼻黏膜[9]。在當前ASF仍在流行的大環境下，豬場空氣中的ET更是增加了豬只對ASF以及豬只其他疾病尤其是呼吸道疾病的易感性。所以，在豬場實施嚴格的生物安全措施時，還要注意清除豬場空氣中的塵埃，盡最大可能減少空氣中的塵埃，從而盡可能地降低空氣中的ET存在。

2.2 豬場環境中內毒素對豬只生產性能的影響

豬場環境中無處不存在著ET，這是由豬場中無處不在的GNB等微生物所決定的。ET進入豬體后，會刺激豬體產生一系列免疫應答反應，從而降低豬只的生產性能，并最終影響到豬場的經濟效益。免疫應答是造成豬只生產性能下降的原因，主要在兩個方面：一是ET進入豬只體內引起的免疫應答反應，會導致豬體發熱（消耗能量），PIF增多（消耗蛋白），并減少豬只的采食量，豬只最終會因“入少出多”而降低生產性能[10]；二是ET引起的免疫級聯反應（Immunologic cascade, IC），會改變豬只體內的代謝而引起營養物質的重新分配，導致一些用于生長的營養物質重新分配到免疫系統，進而降低豬只的日增重與飼料轉化率[11]。據報道，受ET入侵的豬只，其胰島素樣生長因子－ 1（Insulin-like growth factor-1,IGF-1）、前列腺素E2（Prostaglandin E2）、皮質醇（Cortisol）、白細胞介 素 (IL)－ 1β（Interleukin-1β, IL-1β）的含量遠高于對照組的相應指標值[10]。而日采食量與日增重則較對照組分別下降了12.8%與13%[10]。給斷奶仔豬按體重200 ug/kg劑量肌注ET，研究發現：1）飼料利用效率方面，肌注ET的試驗組豬只的日采食量、日增重、飼料轉化效率分別較對照組豬只的相應值降低28%、43%與21%[12]；2）氮平衡試驗方面，肌注ET的試驗組豬只的氮攝入量、氮沉積率與氮表觀消化率分別較對照組豬只的相應值降低27%、45%與9%[12]。這是因為感染ET的豬只，其骨骼肌蛋白質分解率顯著增加，以滿足合成急性期蛋白（Acute phase protein, APP）對氨基酸（Amino acid, AA）的需要[13]。此外，ET誘導產生的IL-1、IL-6與TNF-α等炎癥細胞因子，一方面通過降低IGF-1、生長激素（Growth hormone, GH）等合成代謝激素的釋放以減少蛋白質合成所需的AA，從而將“節流”來的AA用于合成APP；另一方面通過增加糖皮質激素（Glucocorticoid, GC）等分解代謝激素的釋放以增加蛋白質的分解[14]，從而將“開源”來的AA用于合成APP。

2.3 豬場環境中內毒素對豬只腎臟鈉鉀ATP酶（Na-K-ATPase）的影響

豬場環境中的ET導致豬只感染，感染豬只引發的體內系統性免疫應答，導致干擾素-γ（Interferon-γ, IFNG）、TNF-α、IL-1與IL-6等體內促炎性細胞因子（Proin flammatory cytokine,PIC）的表達量顯著增加[15]。在這些PIC的刺激下，腎臟上皮細胞可激活存在于腎臟近曲小管上皮細胞中的一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase, iNOS）[16]的表達，進而產生一氧化氮（Nitric oxide, NO）[17]。所生成的內源性NO因具有擴張血管的作用，從而導致腎血壓與腎小球的濾過率降低[18]。NO與過氧化物反應生成的過氧亞硝酸根離子（ONOO－）[19]是一種強氧化物，可以氧化腎臟近端小管中的鈉鉀ATP酶（Sodiumpotassium ATPase, Na-K-ATPase）活性中心的巰基，從而抑制其活性[20]。此外，所生成的內源性NO對腎臟中Na-K-ATPase的活性亦具有直接的抑制作用，并造成腎臟近曲小管的氧化損傷，進而降低近曲小管的重吸收能力[21]。

3 小結

總之，在當前ASF流行下，認識ET的生物學特性及其對豬只健康的影響；近期意義在于對豬的成功“復產”與成功“拔牙”，維持豬只的健康生產；遠期意義在于開發出有效的細菌ET凈化劑，這是一個包括獸醫學在內的人醫和獸醫學領域所面臨的極富挑戰性的前沿性研究課題。