轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在豬上的研究進展

黃全奎，周松峰，邢 凱，白云華

（1.廣西里建桂寧種豬有限公司，廣西 南寧530105；2.北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，北京102206；3.北京百凈保科技發(fā)展有限公司，北京100193）

轉(zhuǎn)錄組廣義上是指在某一生理或試驗條件下，由單個細胞、組織或個體等所產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA及非編碼RNA；狹義上是指所有mRNA的集合。在一般情況下，如果不特別強調(diào)，轉(zhuǎn)錄組就是指mRNA。轉(zhuǎn)錄組代表了樣本（細胞、組織等）整體的基因表達水平，因此也被稱為“表達譜”，通常采用基因表達譜芯片和RNA-seq技術(shù)來研究。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，測序所需的時間和成本大大降低，其在畜牧行業(yè)得到了大量應(yīng)用及研究，在豬上也不例外?？蒲泄ぷ髡吒鶕?jù)自己的研究目的，針對不同表型、不同處理條件、不同時期及不同組織間的差異，進行轉(zhuǎn)錄組測序，進而篩選差異表達基因，進行功能基因組的研究。

1 不同表型

針對極端表型個體的關(guān)鍵器官或組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，是挖掘影響此表型關(guān)鍵基因的重要方法之一。脂肪沉積在養(yǎng)豬生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用，研究者針對不同脂肪沉積能力的豬做了研究。Chen等針對具有極端生長表型的豬的腹脂、肝臟和背最長肌進行了轉(zhuǎn)錄組測序，分別發(fā)現(xiàn)2 796、1 551和835個差異表達基因，并認為胰島素樣生長因子2（IGF2）、細胞色素P450家族成員1A1（CYP1A1）、肌肌酸激酶（CKM）和羧酸酯酶1（CES1）等基因在脂肪發(fā)育過程中發(fā)揮了重大的作用[1]。Xing等檢測了具有極端背膘厚度的松遼黑豬的脂肪組織和肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組，分別檢測出188和92個差異表達基因，通過功能分析發(fā)現(xiàn)脂肪組織是影響脂肪沉積的主要器官，脂肪酸的從頭合成通路是影響脂肪沉積的主要原因，并在長白豬上有了相同的發(fā)現(xiàn)[2]。Zambonell等檢測了具有極端背膘厚度的意大利長白豬的背膘組織，發(fā)現(xiàn)了86個差異表達基因，主要參與了炎癥反應(yīng)等過程[3]。Lim等比較了極端高低組（n=3）肌內(nèi)脂肪含量的巴克夏豬的背最長肌肌肉組織，檢測到134個差異表達基因，主要參與了脂肪酸的從頭合成和肌肉再生等過程[4]。公豬膻味是一個影響肉質(zhì)的不良性狀，主要是由于雄烯酮和糞臭素在脂肪中的積累而導(dǎo)致的。Gunawan等檢測了具有極端差異背膘雄烯酮含量的豬肝臟和睪丸的轉(zhuǎn)錄組，分別發(fā)現(xiàn)了448和46個差異表達基因，其中免疫應(yīng)答基因6（IRG6）、抗病基因1（MX1）、干擾素誘導(dǎo)基因2（IFIT2）、細胞色素P450家族成員7A1（CYP7A1）、含黃素單氧化酶5（FMO5）和角蛋白18（KRT18）可能是影響公豬膻味的候選基因[5]。生長速度和剩余采食量是豬重要的經(jīng)濟性狀，并且互相影響。Jing等比較了具有極端剩余采食量的長白公豬（10頭），檢測出99個差異表達基因，其中脂肪酸結(jié)合蛋白3（FABP3）、鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白（RCAN）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1A（PGC-1A）、己糖激酶2（HK2）、AMP激活的蛋白激酶r-2調(diào)節(jié)亞單位（PRKAG2）等基因參與了能量代謝和脂肪酸的跨膜運輸[6]。Liu等比較了35日齡左右的高低組剩余采食量的仔豬（n=15），鑒定出1 972個差異表達基因，這些基因參與了小分子生物物質(zhì)的合成等生物學過程[7]。

豬肉品質(zhì)是影響消費者選擇豬肉的重要因素。Li等比較了不同滴水損失的背最長肌的轉(zhuǎn)錄組，鑒定出150個差異表達基因，其中三合蛋白（TRDN）和肌肉生長抑制素（MSTN）可能是滴水損失的主要候選基因[8]。Gi等檢測了不同產(chǎn)仔數(shù)母豬的胎盤組織，發(fā)現(xiàn)了588個差異表達基因，其中白介素-6（IL-6）和內(nèi)皮脂肪酶（LIPG）在胚胎發(fā)育營養(yǎng)供給上發(fā)揮著重要的作用[9]。Zhang等比較了不同產(chǎn)仔數(shù)母豬的卵巢轉(zhuǎn)錄組，檢測出1 243個差異表達基因，其中部分基因參與了類固醇生物合成和卵巢類固醇生成[10]。Zhao等比較了具有極端飼料轉(zhuǎn)化率的豬的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)232個差異表達基因，其中部分關(guān)鍵基因參與了維生素A代謝、脂肪酸代謝和膽固醇類激素代謝等通路，并認為維生素A在豬肝臟中的代謝，對于調(diào)控豬飼料效率具有重要作用[11]。

2 不同品種

在豬長時間的選擇和進化過程中，不同品種在生理特點上產(chǎn)生了很大的差異。通過比較不同品種間的轉(zhuǎn)錄組，得到差異表達基因，為揭示豬生理特點的分子功能解析提供了基礎(chǔ)。不同豬品種間肌肉的發(fā)育形態(tài)、肉質(zhì)品質(zhì)、肌內(nèi)脂肪含量等方面有較大的差異，科研工作者針對不同豬種間的差異做了較多的研究。Li等比較了皖南花豬和大白豬的背最長肌的轉(zhuǎn)錄組，篩選到的差異表達基因部分參與了糖類分解和脂肪酸的代謝的過程[12]。Sun等比較了長白豬和藍塘豬的背最長肌轉(zhuǎn)錄組，篩選到547差異表達基因，主要富集在肌肉生成等過程中[13]。Yang等對沙子嶺豬和大白豬的背最長肌組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序，篩選到488個差異表達基因，其中部分參與了脂肪酸代謝、肌肉發(fā)育等過程[14]。Chen等比較了萊蕪豬和大白豬背最長肌轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了178個差異表達基因，其中部分基因參與脂肪代謝，可能影響了肌內(nèi)脂肪含量的沉積[15]。Hou等比較了瘦肉型豬 長白豬、脂肪型豬 通城豬和小型豬 五指山豬的背最長肌轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)部分差異表達基因參與了脂肪代謝、肌肉發(fā)育等過程[16]。張東杰等比較了民豬和大白豬的背最長肌轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了1 098個差異表達基因，其中部分基因富集在過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號通路等通路，為研究影響肉質(zhì)的遺傳因素提供了依據(jù)[17]。楊建敏等比較了槐豬和杜洛克豬的背最長肌轉(zhuǎn)錄組，檢測到953個差異表達基因，其中部分基因參與了調(diào)節(jié)脂類代謝的通路[18]。Ropkamoik等比較了皮特蘭豬和波蘭長白豬的半膜肌肉組織，檢測到35個差異表達基因，其中部分基因參與了肌肉收縮等過程[19]。Zhao等比較了通城豬和大白豬11個發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出大量差異表達基因，為研究肌肉發(fā)育和肉質(zhì)提供了分子基礎(chǔ)[20]。Li等比較了二花臉豬和大白豬背最長肌的轉(zhuǎn)錄組，篩選到808個差異表達基因，為解釋種間差異奠定了基礎(chǔ)[21]。Xing等比較了松遼黑豬和長白豬背膘組織的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)差異表達基因參與了脂肪酸合成、胰島素抵抗和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等過程[22]。Codina等比較了大白豬和伊比利亞豬睪丸組織的轉(zhuǎn)錄組，檢測到大量差異表達基因，并顯著地富集在配子生產(chǎn)和脂類代謝等通路上[23]。Hu等比較了大蒲蓮豬和長白豬的全血液轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，檢測到83個差異表達基因，其中部分富集在免疫應(yīng)答和脂質(zhì)代謝等通路上[24]。

3 不同處理條件

通過全面分析某一組織在不同處理條件下轉(zhuǎn)錄組表達水平的變化，能夠揭示特定生物學過程的分子調(diào)控機制。在這方面的研究中，通過飼喂不同營養(yǎng)水平的日糧來研究轉(zhuǎn)錄組表達水平是重要組成部分。Og?uszka等比較了飼喂不同不飽和脂肪酸（ω-6和ω-3）長白豬的臀肌和肝臟的轉(zhuǎn)錄組，分別篩選到749個和3 565個差異表達基因，其中部分基因富集在調(diào)控脂肪酸代謝、能量代謝和免疫應(yīng)答等信號通路上，為脂肪酸在豬生長和發(fā)育中的作用打下基礎(chǔ)[25,26]。 wi?tkiewicz等比較了飼喂不同脂肪酸含量日糧的豬肝臟轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A4（APOA4）、長鏈脂酰CoA合成酶5（ACSL5）、細胞色素P 4 5 0家族成員2C49（CYP2C49）、細胞色素P450家族成員2B22（CYP2B22）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶ω-1（GSTO1）等基因在不同處理組中顯著差異表達，揭示它們可能存在共調(diào)控作用[27]。Xia等比較了飼喂高脂高糖日糧的巴馬香豬和對照組的肝臟組織轉(zhuǎn)錄組，篩選到822個差異表達基因，其中部分基因參與了免疫應(yīng)答、MAPK和PPAR等信號通路，為研究高能量飲食對豬肥胖和脂肪肝的分子機制打下基礎(chǔ)[28]。李建平等比較了不同脂肪來源（紅花籽油和椰子油）日糧及對照組之間的豬肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到多個差異表達基因，為其作為飼料的功能研究奠定了基礎(chǔ)[29]。Li等比較了二元（長白h大白）豬和萊蕪豬感染豬圓環(huán)病毒2型35 d前后的腎臟組織的轉(zhuǎn)錄組，從萊蕪豬中篩選出169個差異表達基因，而在長白豬中發(fā)現(xiàn)205個差異表達基因，這些基因主要富集在補體系統(tǒng)、外源物質(zhì)代謝等通路上[30]。

4 不同時期

豬在不同的發(fā)育時期有著不同的生物學特點。通過比較不同時期豬某些特定組織的轉(zhuǎn)錄組來鑒定基因的功能是研究重要手段之一。Song等比較了長白豬未成熟和成熟的睪丸組織的轉(zhuǎn)錄組，篩選到10 095個差異表達基因，其中有242個差異表達基因參與了生精的過程，為了解豬的生精過程和性成熟的分子機理打下基礎(chǔ)[31]。Lee等比較了5 d和180 d豬睪丸組織的轉(zhuǎn)錄組，篩選到607個差異表達基因，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）、谷胱甘肽過氧化酶1（GPX1）、趨化因子受體1（CCR1）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）、白細胞分化抗原14（CD14）等基因可作為豬生精干細胞的生物標記[32]。Jiang等比較了脂肪細胞和前脂肪細胞在發(fā)育0 d、2 d和4 d時的轉(zhuǎn)錄組，分別在兩細胞中篩選到985個和1 469個差異表達基因，其中576個基因是在兩種細胞中共同差異表達的，并認為PPAR信號通路在兩種脂肪細胞發(fā)育過程中起著重要作用[33]。Li等比較了脂肪型榮昌豬不同時期的脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組，篩選到差異表達基因4 403個，為研究脂肪組織的發(fā)育提供了基礎(chǔ)[34]。Shan等比較了巴馬香豬和藏豬不同發(fā)育時期腦下垂體的轉(zhuǎn)錄組，檢測到大量差異表達基因，其中生長激素（GH）、催乳素（PRL）、黃體生成素β亞基（LHB）和促卵泡激素β亞基（FSHB）等基因可能在發(fā)育過程中起著重要的作用[35]。Lin等比較了母豬發(fā)情后12 d、18 d和25 d的子宮內(nèi)膜組織的轉(zhuǎn)錄組，分別發(fā)現(xiàn)1 557、8 951和2 345個差異表達基因，為研究豬的子宮內(nèi)膜功能打下基礎(chǔ)[36]。

5 不同組織

不同組織在生物體內(nèi)發(fā)揮著不同的作用，通過比較其轉(zhuǎn)錄組的差異，是挖掘基因功能的重要手段。Wang等比較了豬皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要富集在免疫應(yīng)答等通路，揭示了不同脂肪組織在豬體內(nèi)發(fā)揮著不同功能[37]。Mach比較了不同的豬小腸組織（十二指腸、空腸）的轉(zhuǎn)錄組，篩選到大量的差異表達基因，主要富集在基本的生物學過程中，為揭示豬腸道的精細功能奠定基礎(chǔ)[38]。Li等比較了豬肱二頭肌和比目魚肌的轉(zhuǎn)錄組，鑒定到52個差異表達基因，主要富集在與肉色性狀相關(guān)的通路上，揭示了部分調(diào)控肉色的分子機制[39]。Gan等比較了榮昌豬的肝臟組織和腦組織的轉(zhuǎn)錄組，鑒定出大量差異表達基因，為更確切地了解豬肝臟和腦的分子功能打下基礎(chǔ)[40]。

6 展望

綜上所述，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)廣泛地研究了豬的生長發(fā)育、脂肪代謝、肌肉生長、繁殖生理、免疫應(yīng)答等各個生理過程，已經(jīng)成為鑒定mRNA表達豐度和鑒定新轉(zhuǎn)錄本的重要技術(shù)手段。同時結(jié)合如小的非編碼單鏈RNA（miRNA）組、長鏈非編碼RNA（lncRNA）組、全基因甲基化組、全蛋白組等組學信息，為鑒定基因的生物學功能和調(diào)控機制提供了新的思路。但是大部分的轉(zhuǎn)錄組測序研究只是構(gòu)建了差異表達基因參與的通路，其分子調(diào)控和遺傳機制還有待進一步研究。這也是未來在轉(zhuǎn)錄組測序基礎(chǔ)上的研究重點。