人源性肝癌組織移植模型研究進展

劉世芳，李宜航，陳德力，蘇 晶，呂亞娜，丁 璇，李 光，孫曉波

(1. 中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所云南分所藥理中心，云南 景洪 666100；2. 西雙版納州傣藥南藥重點實驗室，云南 景洪 666100；3. 中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所海南分所植物化學中心，海南 海口 570311；4. 中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100093)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是危害極大的惡性腫瘤，研究者為能深入研究肝癌的發病機制及篩選藥物活性，建立多種肝癌動物模型。常見的肝癌動物模型包括化學試劑誘導肝細胞癌動物模型、肝癌細胞或肝癌組織移植模型以及遺傳修飾肝細胞癌模型等[1]，但目前這些造模方法均存在一定的局限性。化學試劑誘導肝細胞癌動物模型是通過致癌物誘導形成，但在致癌物、試驗動物等方面的選擇有很大缺陷，且誘導時間長，動物死亡率高，腫瘤發生時間、位置、病灶數等差異較大；遺傳修飾肝細胞癌動物模型，通常會出現基因組不穩定，其形成的肝癌始終是鼠源性，與人自身肝癌的形成終有一定差異，對研究肝癌的發生發展機制、藥物的篩選以及新的治療方法研發等有很大的制約性。

PDX模型在腫瘤藥物篩選以及實現個體化治療方面更具有優勢[2]，肝癌PDX模型也在不斷的開發利用。肝癌PDX模型是將肝癌患者的肝癌組織移植到免疫缺陷小鼠皮下或者經皮下傳代后移植到肝內而構建的肝癌動物模型[3]。該模型能很好保持原代腫瘤的組織病理學、生長及轉移特性，并在多次傳代后仍然能夠較大程度保留原代腫瘤的特性，與原始患者腫瘤密切相關，具有重要的科研價值。

1 肝癌PDX模型建立及組織凍存與復蘇

肝癌PDX模型建立方法主要有兩種方法：①皮下移植：獲取新鮮的肝癌組織切成小塊組織或研磨為勻漿，與基質膠充分混合，再將選好的組織用套管針將腫瘤塊穿刺至免疫缺陷品系小鼠皮下，或者吸取勻漿組織注射到皮下，并用滅菌棉簽按壓進針部位，避免出血及組織溢出。②皮下-肝內移植：在皮下移植的基礎上進行一定次數的傳代，按照皮下移植的方法將癌組織處理，對免疫缺陷鼠進行麻醉，打開小鼠腹腔，暴露出肝臟。在肝臟外葉刺出小的隧道，把制備好的瘤塊置入隧道或者吸取勻漿組織注入肝臟，或用可吸收縫合線將癌組織直接與肝臟進行縫合，輕壓止血。為保證后期實驗，通常將獲得的癌組織進行凍存，在后期需要實驗時再復蘇，且全程在無菌操作臺中進行，以保證組織的無菌性。

組織凍存方法：用無菌眼科剪將壞死的腫瘤組織、脂肪組織、纖維組織剔除，盡可能保存具有活性的組織。將組織剪成50～100 mm3小塊，用含有青霉素、鏈霉素的緩沖液反復沖洗3次，把組織塊上血跡清洗干凈。肝癌組織瘤塊放入含有10% DMSO和90% FBS的凍存管中，將凍存管放入凍存盒在4 ℃放置1 h，轉入-20 ℃ 2 h，再轉入-80 ℃過夜，最后置液氮中長期保存。

組織復蘇方法：遵從慢凍速溶的原則，將液氮中的凍存管取出，迅速置于37 ℃的水浴鍋中進行快速溶解，并搖動凍存管加速凍存液溶解，解凍后將癌組織塊取出，在超凈生物臺上用含有青霉素、鏈霉素的DMEM培養基將組織塊沖洗后建模備用，癌組織凍存復蘇后，應盡可能在30 min內完成。

2 肝癌PDX模型應用

抗腫瘤藥物開發失敗率高的最主要原因是缺乏合適的模型。目前相關藥物的活性篩選主要通過體外培養細胞系和體內建立動物模型開展抗腫瘤實驗[4]。評價藥物的抗癌活性以及藥物作用機制時，則利用肝癌HepG2和SMMC-7721細胞株篩選[5-6]，但還是以動物體內實驗結果為主。鼠源性動物模型中，由于產生了巨大的生物學特性改變，無法保持與原發腫瘤的一致性，使得對藥物活性的評價效果較差，新藥的作用機制也不能準確反映實際患者體內藥物的作用原理，因此在開展臨床治療方向的研究也存在一定障礙。Bissig-Choisat等[2]建立的肝癌PDX模型在連續傳7代后，組織學分析顯示仍然保留HB腫瘤組分并在連續移植模型中檢測到這種腫瘤的罕見間充質成分。移植模型的癌組織由于仍然保留其正常的結構和功能，能夠更準確地反映體內情況，是最為接近臨床患者模型[7-8]。目前該模型已廣泛應用于肝癌藥物篩選、個體化治療以及新治療方向研發等多方面的應用。

2.1 藥物篩選PDX模型做為理想的臨床前模型廣泛運用于腫瘤的基礎與臨床研究，特別是對傳統、新型抗癌藥物敏感性、檢測腫瘤發生發展及侵襲轉移的機制，尋找腫瘤新型標志物均有重要意義[9-10]。PDX模型對抗腫瘤藥物的反應與臨床反應基本平行，與體外實驗相比具有更高的可靠性，已經應用于肝癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的新藥研發[11]。

陶其飛等在抗肝癌藥物的篩選中，通過對比不同敏感性的肝癌PDX模型的表達譜，篩選了Sorafenib耐藥性相關的標志物并初步探討其耐藥機制[12]。Huynh等[13]通過建立肝癌PDX模型對Cisplatin、Oxaliplatian、Iressa、SarCNU、Doxorubicin、維生素D類似物EB1089進行活性篩選，發現Cisplatin、Oxaliplatian、Iressa、維生素D類似物EB1089對小鼠腫瘤的生長速度沒有影響，SarCNU、Doxorubicin有明顯的抑制作用，并利用肝癌PDX模型對抗腫瘤藥物Bevacizumab、Rapamycin進行療效觀察，發現Bevacizumab和Rapamycin聯合用藥比單一用藥效果更好，能有效抑制腫瘤的生長[14]。Wang等對Rapamycin、Sorafenib抗腫瘤藥物的療效進行觀察，發現rapamycin與Sorafenib聯合用藥時比單一用藥效果更好[15]。由此可見，肝癌PDX模型作為新藥開發的臨床前模型，能夠有效評估抗腫瘤藥物的藥效并闡明其作用機制，在新藥研發過程中將發揮重要作用。

2.2 個體化治療目前研究的抗肝癌藥物主要包括酪氨酸激酶抑制劑Sorafenib、Regorafenib、Brivanib；小分子靶向抑制劑Tivantinib、Capmatinib；化療藥物Doxorubicin、Oxaliplatian等，然而進入肝癌臨床試驗的靶向藥物中，很多藥物被證實在總體人群中無效。即使在臨床前實驗中被證實Sorafenib具有很好的抗肝癌活性，但在臨床應用中同樣有約50%的患者無效，患者用藥前無法判斷其療效[16]。其原因可能是同種的肝癌患者之間存在著個體差異，常規治療方案往往無法獲得療效。因此針對不同患者優化個體化治療方案是提高藥物療效的有效途徑。肝癌PDX模型的建立將在其中發揮著重要作用。

陶其飛[12]利用肝癌PDX模型進行詳細的基因組、表達譜特征描述，通過在患者肝癌組織中發現的常見變異基因找到對應的模型，為精準治療方案提供了研究平臺。黃昊等[17]利用肝癌患者術后腫瘤組織建立肝癌PDX模型并評價Sorafenib藥效，同時對接受Sorafenib單藥治療患者進行臨床觀察，發現術后6個月肝癌出現復發，且伴腹腔淋巴結轉移，這與建成的肝癌PDX模型的藥效學評價結果相似，以此推斷該患者先天對索拉非尼具有耐藥性。可見肝癌PDX模型能更好地反映藥物在個體化患者中的作用，該模型的建立對于抗肝癌活性的臨床前評估、治療方案的確定和預后具有重要的轉化意義，有望為腫瘤患者個體化治療帶來新突破。

2.3 其它方面的應用肝癌PDX模型還用于研究肝癌的發生發展機制以及治療方法等方面。有研究者證明OPN和EMT標記表達相互關聯，具有侵襲性生長和轉移的特性。RNA適配體與細胞的OPN結合，自分泌和旁分泌適配體能消除OPN與細胞表面結合。在移植模型中，RNA適配體能顯著抑制腫瘤生長。分析在體外和離體環境中腫瘤細胞的表達顯示出EMT的顯著降低該適體的標記表達，OPN與細胞表面整合素受體的結合是EMT標記表達所需，OPN可靶向明顯降低肝癌的EMT和腫瘤生長[18]。

目前，肝癌的治療方法主要為肝切除、移植、化療等，雖然治療方法取得很大進步，但是幾十年來，患者5年生存率一直保持在10%左右，因此亟需研發更加有效的治療方法。Jiang等[19]利用肝癌PDX模型發現GPC3-CAR T細胞能夠有效消除PDX中的腫瘤，GPC3-CAR T細胞療法有望作為HCC的候選者治療。Wang等[20]基于肝癌PDX模型研究利用納米載體將siRNA傳遞到HCC，特異性的與腫瘤結合并顯著抑制Luc基因的表達，為HCC的治療提出新的方向。

3 肝癌PDX模型成瘤的關鍵因素與不足

3.1 肝癌PDX模型成瘤的關鍵因素研究發現腫瘤組織的分化程度與移植成功率呈正相關的關系，分化程度低，侵襲度高及易轉移的肝癌組織更容易移植成功；反之，成瘤率則較低[21]。移植部位不同對成瘤率也有不同的影響，目前建模的移植部位主要為皮下移植和肝內移植。皮下移植操作簡單，接種的部位在裸鼠的背部、腋下，選擇血管較豐富的部位，易于監測腫瘤的生長，但皮下移植所生長的腫瘤不會發生轉移。而由于原位移植癌組織的生長的微環境更接近于人體內的生長環境，保持原代腫瘤中的動態生長狀況[22]，因此肝內移植是肝癌腫瘤移植模型研究的新方向。

除此之外，裸鼠的品種、年齡、飼養環境等因素都可能對成瘤率造成影響，目前建模選用的鼠種主要有NCG、SCID、NOD/SCID、BALB/c等免疫缺陷鼠。不同品系的裸鼠免疫力有差異，因此肝癌移植成功率也會有所不同。同時由于免疫缺陷鼠的飼養需要嚴格環境，宜飼養于SPF級的IVC籠具中，溫度、濕度等多種因素都可能對其生長造成影響。另一方面隨著年齡的增長，裸鼠自身會患有多種疾病導致裸鼠死亡，如BALB/c裸鼠老年心臟有某些病變，常因動脈硬化對成瘤率造成影響，部分SCID小鼠隨年齡增長淋巴細胞功能恢復，對異物有排斥反應，同樣影響成瘤率。

3.2 肝癌PDX模型不足PDX模型發展已有30多年的歷史，由于移植肝癌組織保留了原代腫瘤的主要組織特征、突變位點、基因表達等特性，是目前較理想的肝癌模型，在新型藥物的篩選、治療方法的研究上已取得了一定的成效[23]。然而該模型也有一定的缺陷，因皮下移植瘤細胞生長微環境與原發腫瘤生長微環境有差異，影響肝癌細胞的表達，肝內移植生長環境雖然與原發性腫瘤生長環境相似，但肝內移植難以監測腫瘤生長的大小，且要求技術較高，易造成小鼠的死亡。其次，由于目前該造模方法花費時間長且成瘤率較低，臨床上很難有足夠的時間開展相關研究，這對實現個體化治療將會是重大的挑戰[24]。如何改善皮下移植腫瘤的微環境相似性和提高肝內移植成功率將是建立肝癌PDX模型的一個重要的研究方向。

另一方面，肝癌PDX模型的應用還存在物種差異問題，人和鼠兩者間物種差異尚無法消除，因此仍有學者對肝癌組織移植的保真度仍然持懷疑態度。并且人肝癌組織在離體取材及剪切的處理、移植后適應宿主新環境等各方面是否會導致腫瘤的某些亞群選擇性生長，是否能夠完全保持人肝癌的生物學特性還有待驗證。為了改善這一現狀，近年來[25]，具有人類免疫系統的人源化PDX小鼠模型正在開發和應用。

4 展望

隨著對肝癌模型研究的深入，研究者們更能清楚的認識到優異的肝癌模型對肝癌研究的價值。傳統的肝癌動物模型已不能滿足現有肝癌研究的需求，需要開發更切合人自身生物學特性的肝癌模型。肝癌PDX模型最大程度的保留了人類肝癌的生物學特性、組織病理學特征，決定了該模型在肝癌研究領域發揮重要作用，是目前最為理想的肝癌動物模型。Bissig-Choisat等[2]建立肝癌PDX模型，用mek1抑制劑trametinib和泛類I-pi3激酶抑制劑nvp-bkm120靶向治療侵襲性肝細胞惡性腫瘤，結果發現可顯著抑制其生長，從而證實肝癌PDX模型是研究腫瘤生物學和患者腫瘤特異性的一個有價值的工具。肝癌PDX模型已應用藥物篩選、藥物療效評價、肝癌的發生發展等多方面的研究，其它方面潛在的應用價值也在逐步的挖掘。

由于肝癌PDX模型能更直接、客觀地將腫瘤自身生長環境以及疾病發展情況展現出來，因此對臨床上研究具有高度的相關性。與其它肝癌動物模型相比，肝癌PDX模型取材于不同的患者，保留了患者腫瘤的異質性符合腫瘤生物學治療基本原則，為個體化抗癌治療方案的制定，實現肝癌患者的精準用藥提供了可能，同時為抗腫瘤藥物研發、藥效評價、新的治療方法的研發也提供一個新的平臺。