大蒜提取物抗白念珠菌作用機(jī)制研究進(jìn)展

胡萬(wàn)超， 唐建國(guó)

1 概述

長(zhǎng)期以來(lái)，中醫(yī)以及其他國(guó)家的傳統(tǒng)醫(yī)療就有將大蒜作為一種藥物應(yīng)用于疾病的預(yù)防與治療。現(xiàn)如今中國(guó)、印度、美國(guó)、英國(guó)以及歐洲的藥典中都收錄了大蒜及其制劑。

大蒜提取物主要是大蒜中的有效成分，隨著醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，大蒜提取物也被發(fā)現(xiàn)有多種藥理作用，如抗腫瘤，抗細(xì)菌、真菌和原蟲感染，以及對(duì)心腦血管疾病有較好療效[1-4]。大蒜提取物主要包括蒜氨酸（alliin）、蒜酶（alliinase）、大蒜辣素（allicin）、大蒜素（diallytrisulfide）。其中蒜氨酸在蒜酶的催化裂合下產(chǎn)生大蒜辣素，而大蒜素是大蒜辣素的降解產(chǎn)物之一，研究發(fā)現(xiàn)大蒜中最重要的生物活性成分為大蒜辣素[5-6]。

白念珠菌是一種機(jī)會(huì)性感染的真菌病原體，可致人體表面深部感染。近年來(lái)，由于全球艾滋病危機(jī)[7]，免疫缺陷病患者壽命延長(zhǎng)，植入性器械使用增加，廣譜抗生素的長(zhǎng)期使用，腫瘤患者放化療治療增加和免疫抑制劑使用增多，使得白念珠菌感染發(fā)病率和死亡率逐年上升[8-9]。研究表明念珠菌感染是導(dǎo)致醫(yī)療相關(guān)血流感染的第三位或第四位原因，也是引起重癥監(jiān)護(hù)病房血流感染的主要原因[10-12]。

治療白念珠菌感染的經(jīng)典藥物有唑類、棘白菌素類、多烯類等，但由于長(zhǎng)期抗真菌藥物的使用，導(dǎo)致臨床上出現(xiàn)越來(lái)越嚴(yán)重的耐藥菌株[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，大蒜提取物單獨(dú)使用具有抗真菌作用，或者輔佐抗真菌藥物治療白念珠菌感染能夠取得更好的療效[14-16]。本文將重點(diǎn)介紹大蒜提取物抗白念珠菌作用的機(jī) 制。

2 作用機(jī)制

2.1 大蒜提取物對(duì)白念珠菌生物特性的影響

白念珠菌是一種具有酵母相和菌絲相的雙相性條件致病真菌，其中菌絲相對(duì)宿主的黏附和侵襲能力強(qiáng)，而酵母相毒力較弱，酵母相在適宜條件下可以生成芽管，然后芽管進(jìn)一步發(fā)展成為菌絲，從而完成酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)變，這一過(guò)程與白念珠菌致病性密切相關(guān)[17-18]。有實(shí)驗(yàn)證明，大蒜素可以有效抑制白念珠菌芽管的生長(zhǎng)[19-20]。一方面可以阻止芽管向菌絲相轉(zhuǎn)變，另一方面由于芽管上有特異性的抗原成分，這些抗原能增強(qiáng)菌體黏附上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的能力，并能阻止中性粒細(xì)胞對(duì)菌體的吞噬殺傷作用[21]。阻止芽管的生長(zhǎng)，也降低了念珠菌對(duì)上皮細(xì)胞的黏附和毒力。抑制菌絲形成的機(jī)制可能與SIR2基因（沉默子調(diào)控基因）的下調(diào)有關(guān)[22-23]，具體作用機(jī)制目前尚未明確。

白念珠菌生長(zhǎng)的過(guò)程伴隨有生物膜的形成，生物膜將白念珠菌包裹，當(dāng)宿主細(xì)胞行使機(jī)體防御或者抗菌藥物作用于白念珠菌時(shí)，生物膜就會(huì)對(duì)白念珠菌形成保護(hù)作用，從而增強(qiáng)白念珠菌的感染能力并產(chǎn)生耐藥性。同時(shí)生物膜也易附著于植入性材料表面，增加靜脈插管、氣管插管等侵襲性操作時(shí)白念珠菌的感染率[24]。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素對(duì)白念珠菌生物膜的形成有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)濃度相關(guān)性和時(shí)間相關(guān)性。時(shí)間相關(guān)性表現(xiàn)為抑制率隨生物膜的成熟度逐漸降低，對(duì)生物膜形成的早期（0～11 h）抑制作用最為顯著，而早期階段主要涉及酵母相黏附、定植以及菌絲形成[12，25-27]。所以早期使用大劑量的大蒜素，對(duì)預(yù)防和治療白念珠菌感染有更好的效 果。

也有研究顯示一些重要的基因也參與了白念珠菌生物膜的形成。如ALS家族基因（凝集素樣序列家族）和HWP1基因（菌絲細(xì)胞壁蛋白基因），大蒜素可以顯著下調(diào)念珠菌中HWP1基因的表達(dá)，可能是其抑制生物膜形成的基因靶點(diǎn)，目前對(duì)主要的分子機(jī)制仍知之甚少[28]。

白念珠菌在生長(zhǎng)的過(guò)程中分為三個(gè)時(shí)期，遲緩期（0～24 h）、對(duì)數(shù)期（24～48 h）和靜止期（48～72 h），有研究顯示大蒜提取物可以抑制白念珠菌遲緩期的生長(zhǎng)，使其延長(zhǎng)到48 h，高濃度時(shí)還可以殺滅白念珠菌[29]。

2.2 大蒜提取物對(duì)白念珠菌生物酶的影響

抗生素的作用機(jī)制主要是與微生物中含巰基（-SH）的基團(tuán)快速反應(yīng)，從而抑制含巰基的酶。大多數(shù)酶都含有巰基基團(tuán)，這些基團(tuán)涉及直接催化反應(yīng)，能夠維持酶結(jié)構(gòu)的完整性，能與底物結(jié)合，也可以參與變構(gòu)效應(yīng)，從而影響酶的調(diào)控[30]。大蒜提取物中含有硫代亞磺酸鹽和烯丙基硫醚等化合物，這些含硫有機(jī)物可以與巰基結(jié)合，主要作用方式有：①烯丙基硫醚與微生物巰基結(jié)合形成各自穩(wěn)定的二硫化合物，從而使蛋白失活；②競(jìng)爭(zhēng)性抑制巰基化合物（如半胱氨酸或谷胱甘肽）的活性；③非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，即在變構(gòu)位點(diǎn)通過(guò)氧化結(jié)合巰基基團(tuán)來(lái)抑制酶的功能。大蒜提取物通過(guò)這三種方式與微生物中含巰基的酶結(jié)合，從而抑制白念珠菌的生長(zhǎng)[31]。例如，有研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是一種含巰基酶，大蒜提取物中所含的化學(xué)成分二烯丙基二硫化物可以作用于細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)靶點(diǎn)，抑制酶的活性，如果加入谷胱甘肽，此抑制作用可以消失[32]。

白念珠菌能夠產(chǎn)生蛋白酶和磷脂酶，這二種水解酶會(huì)導(dǎo)致組織損傷，增加白念珠菌的侵襲力。大蒜提取物中的有機(jī)化合物成分二烯丙基二硫化物（DADS）和丙烯基硫（DAS）可以明顯抑制蛋白酶和水解酶的分泌[33]。也有研究發(fā)現(xiàn)將大蒜提取物中的有機(jī)硫化物變?yōu)闊o(wú)機(jī)硫化物可以增強(qiáng)其抗白念珠菌的效果[34]。

大蒜素也可以間接破壞微生物生長(zhǎng)所需的酶，從而達(dá)到抗真菌的效果。臨床上有研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌開(kāi)始對(duì)抗真菌藥物耐藥，如兩性霉素B，而大蒜素聯(lián)合兩性霉素B可以增加藥物抗真菌療效[35-36]。兩性霉素B主要抗菌作用是破壞白念珠菌的液泡膜。真菌的液泡中聚集了各種水解酶，包括蛋白酶和核酸酶，還有很多細(xì)胞器，它們具有滲透調(diào)節(jié)、離子穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞體積調(diào)節(jié)的作用。而液泡膜可以維持液泡的完整性，其中麥角甾醇是保證液泡膜流動(dòng)性和膜相關(guān)功能的必需物質(zhì)，同時(shí)液泡膜在酵母細(xì)胞內(nèi)吞和同型融合中起至關(guān)重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可以抑制從質(zhì)膜到液泡膜的麥角甾醇轉(zhuǎn)運(yùn)，從而使液泡破壞，水解酶和細(xì)胞器損害[37-38]。也有研究發(fā)現(xiàn)大蒜油具有親脂性，可以穿透細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜，導(dǎo)致線粒體和其他液泡內(nèi)細(xì)胞器損傷，最終導(dǎo)致白念珠菌死亡[39]。

早在1956年Wills[32]就證明大蒜提取物對(duì)許多酶都有抑制作用，例如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、琥珀酸酶、黃嘌呤氧化酶等，大多是含巰基的酶，但是否在抗白念珠菌中發(fā)揮作用，只有上述部分得到了證實(shí)，其他的酶還有待進(jìn)一步研究。

2.3 大蒜提取物引起白念珠菌氧化應(yīng)激反應(yīng)

氧化應(yīng)激是細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一，其產(chǎn)生的活性氧（ROS）被認(rèn)為是許多生物和細(xì)胞系統(tǒng)中細(xì)胞毒性最敏感的預(yù)測(cè)因子，也是一種公認(rèn)的細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因子，它可以促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、核分裂、染色質(zhì)縮合、細(xì)胞腫脹和膜破壞（主要由于脂質(zhì)過(guò)氧化）[40]，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[41]。目前發(fā)現(xiàn)主要的作用機(jī)制：①還原型谷胱甘肽生成減少，大蒜提取物可以顯著降低過(guò)氧化氫酶，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，導(dǎo)致谷胱甘肽生成減少，而谷胱甘肽是細(xì)胞氧化還原反應(yīng)中一種重要的還原緩沖液，可以防止氧化性ROS和自由基的產(chǎn)生；②細(xì)胞內(nèi)電化學(xué)勢(shì)能失衡，還原性谷胱甘肽生成減少，使白念珠菌細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽（GSH/GSSG）比例失調(diào)，破壞細(xì)胞內(nèi)電化學(xué)勢(shì)能，直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[42]；③DADS抑制線粒體呼吸鏈，包括電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅱ～Ⅳ間的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)，以及線粒體ATP合酶和葡萄糖6磷酸脫氫酶，不僅會(huì)導(dǎo)致白念珠菌細(xì)胞線粒體受損，對(duì)自由氧的清除能力降低，ATP合成減少也使還原型輔酶Ⅱ（NADPH）的含量降低，導(dǎo)致谷胱甘肽的含量降低，白念珠菌破壞和死亡[43-45]；④直接調(diào)控氧化應(yīng)激相關(guān)的基因，有研究顯示，大蒜提取物可以誘導(dǎo)關(guān)鍵基因的差異表達(dá)，這些基因主要集中在19個(gè)KEGG通路中，包括參與氧化還原、致病性以及細(xì)胞對(duì)藥物和饑餓反應(yīng)的基因[39]。

也有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素作用于Yap1p基因，與釀酒酵母對(duì)大蒜素的耐藥性相關(guān)。Yap1p基因是釀酒酵母氧化應(yīng)激反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子，主要調(diào)節(jié)抗氧化劑和谷胱甘肽的合成[46]。Yap1p在白念珠菌中的作用目前還未開(kāi)展研究，但有一些研究發(fā)現(xiàn)大蒜素作用于白念珠菌導(dǎo)致大量基因的差異表達(dá)，應(yīng)當(dāng)注意這些基因的表達(dá)，可能不僅與抗菌性相關(guān)，還可能與產(chǎn)生耐藥性相關(guān)。相關(guān)基因的具體作用機(jī)制目前報(bào)道還很少，需要進(jìn)一步研 究。

2.4 大蒜提取物與機(jī)體免疫反應(yīng)

白念珠菌是一種機(jī)會(huì)性致病菌，當(dāng)宿主免疫功能低下時(shí)，感染白念珠菌的概率會(huì)升高，因此機(jī)體免疫功能在防御白念珠菌入侵中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，大蒜提取物可以通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫來(lái)抵抗白念珠菌感染。

在細(xì)胞免疫方面，大蒜素可以通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的抗白念珠菌能力，主要與提高小鼠NO和IL-12 水平有關(guān)， NO是由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的微生態(tài)氣體，在抗白念珠菌反應(yīng)中發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，同時(shí)NO與活化巨噬細(xì)胞殺白念珠菌能力成正相關(guān)。而IL-12可刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌IFN-γ，IFN-γ不僅可促進(jìn)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）， 提高抗原提呈效率，而且可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。IL-12也可以直接活化NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞的殺菌活性[47-48]。也有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素不僅可以提高正常小鼠T細(xì)胞的增殖活性和IFN-γ水平，也能夠增強(qiáng)免疫缺陷小鼠T細(xì)胞的增殖活性和IFN-γ水平[49]。

有研究發(fā)現(xiàn)嗜中性粒細(xì)胞的非特異性免疫功能是機(jī)體抵抗全身性白念珠菌感染的重要防御機(jī)制，而大蒜素可以增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞吞噬和殺菌活性來(lái)抵抗白念珠菌的入侵，且在一定范圍呈濃度依賴性[50]。

在體液免疫方面，大蒜素可以提高小鼠IL-4和IgG水平，IL-4主要由T細(xì)胞產(chǎn)生，能促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、分化和抗體的產(chǎn)生，因此又被稱為B細(xì)胞生成因子，所以大蒜素在增強(qiáng)B細(xì)胞體液免疫中發(fā)揮了重要的作用[51-52]。

大蒜提取物對(duì)宿主免疫方面的研究目前都集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，主要通過(guò)發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子和蛋白的改變來(lái)顯示免疫學(xué)機(jī)制，但更為基礎(chǔ)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和免疫學(xué)分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.5 大蒜提取物的特殊抗菌機(jī)制

有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)Cu2+和Zn2+表達(dá)缺陷的念珠菌對(duì)大蒜提取物敏感性很高，同時(shí)大蒜提取物也可以通過(guò)抑制Cu2+和Zn2+的攝取，或者是抑制Cu2+和Zn2+金屬蛋白來(lái)降低正常菌株中金屬離子的含量，由此增加念珠菌對(duì)大蒜提取物的敏感性，增強(qiáng)抗菌療效[53]。

也有一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)大蒜素對(duì)念珠菌感染的小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)和腎上腺功能有調(diào)節(jié)作用[54-55]，但是否對(duì)治療白念珠菌感染有協(xié)同效應(yīng)，以及具體作用機(jī)制，目前還未有進(jìn)一步的研 究。

3 結(jié)論

綜上所述，大蒜提取物可以通過(guò)對(duì)白念珠菌以及宿主免疫系統(tǒng)兩方面的影響，來(lái)達(dá)到抗白念珠菌感染的效果。對(duì)白念珠菌的影響主要表現(xiàn)在抑制菌絲、生物膜的形成和芽管生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞生存必需酶的抑制以及引起細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。對(duì)宿主方面，大蒜提取物主要是通過(guò)增強(qiáng)人體免疫功能來(lái)抵御白念珠菌的侵襲，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。但目前對(duì)于這些機(jī)制的深入研究還不是很多，而且沒(méi)有將其與臨床實(shí)踐結(jié)合，來(lái)增強(qiáng)臨床治療白念珠菌感染的療效。進(jìn)一步加強(qiáng)大蒜提取物抗白念珠菌的深入研究，也有助于對(duì)大蒜提取物相關(guān)藥物的臨床推廣。