慢性傷口細(xì)菌生物膜的研究進(jìn)展

程海濤，黃桂玲

（1.長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北430000；2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院）

慢性傷口是指經(jīng)過臨床治療6 個(gè)月后，完全沒有愈合跡象的傷口。壓瘡、糖尿病足潰瘍、動(dòng)靜脈潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍、腫瘤傷口等是慢性傷口的典型代表[1],目前臨床上常采用的手段主要有手術(shù)清創(chuàng)、自溶性清創(chuàng)，同時(shí)輔以局部負(fù)壓真空吸引、高壓氧等治療[2]。2014版臨床實(shí)踐指南提出：細(xì)菌生物膜（BBF）的評估和治療是慢性傷口研究領(lǐng)域的最新前沿。其作為細(xì)菌、細(xì)胞分泌的產(chǎn)物和分泌的細(xì)胞外基質(zhì)以及壞死的碎片等混合成的一種膜性組織[3]，對慢性傷口治療以及護(hù)理具有重要影響。現(xiàn)將慢性傷口的細(xì)菌生物膜形成機(jī)制、特點(diǎn)、去除方法以及慢性傷口愈合過程中參與的相關(guān)因子綜述如下。

1 細(xì)菌生物膜形成機(jī)制

細(xì)菌生物膜形成機(jī)制主要包括3 方面：①在嚴(yán)重營養(yǎng)不良、超低酸堿度（pH）以及極高滲透壓因素下，浮游細(xì)菌通過黏附因子黏附在創(chuàng)面[4]。②抗生素濫用導(dǎo)致耐藥細(xì)菌大量繁殖擴(kuò)張，形成生物膜[5]。③群體感應(yīng)(QS)機(jī)制，包括QS 分子作用和對上皮細(xì)胞的刺激。QS 分子方面，QS 分子誘導(dǎo)機(jī)體感染的中性粒細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞凋亡，以凋亡細(xì)胞為食，通過中性粒細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞凋亡后的氧化酶和降解酶破壞機(jī)體，造成生物膜中的細(xì)菌大面積擴(kuò)散，銅綠假單胞菌的高絲氨酸內(nèi)酯信號分子（AHL）和假單胞菌喹諾酮信號（PQS）對巨噬細(xì)胞激活作用下降，機(jī)體免疫向Th2 型發(fā)展，導(dǎo)致創(chuàng)面炎癥狀態(tài)不能轉(zhuǎn)歸，傷口遷延不愈[6]。上皮細(xì)胞的刺激作用方面，金黃色葡萄球菌生物膜會(huì)導(dǎo)致上皮角化細(xì)胞凋亡并限制其生長。α-毒素作為金黃色葡萄球菌形成生物膜的關(guān)鍵物質(zhì)，會(huì)通過對上皮角化細(xì)胞的誘導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞毒性反應(yīng)，最終迫使其凋亡。一般情況下，當(dāng)感染傷口只有浮游菌時(shí)，角化細(xì)胞首先會(huì)細(xì)菌內(nèi)化，然后會(huì)迫使其凋亡，而在生物膜中，不需要經(jīng)歷內(nèi)化過程，而是可以直接誘導(dǎo)其凋亡，這就會(huì)造成細(xì)菌大面積繁殖，覆蓋慢性傷口表面，最終延遲傷口愈合。生物膜組成成分能夠限制中性粒細(xì)胞趨化和分泌，并且會(huì)迫使成纖維細(xì)胞提前衰老，從而降低機(jī)體免疫功能以及阻礙成纖維細(xì)胞重建最終導(dǎo)致傷口不愈合。可見，造成創(chuàng)面不愈合的機(jī)制是在特殊細(xì)菌的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)之上的相對性的研究機(jī)制，主要細(xì)菌是銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌；主要參與細(xì)胞是中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞、上皮角化細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞。

2 慢性傷口細(xì)菌生物膜的特點(diǎn)

①細(xì)菌生物膜廣泛存在于慢性傷口，且不宜檢出。慢性傷口必然有細(xì)菌黏附，開放性傷口2 d 不清創(chuàng)，皮膚周圍的細(xì)菌就會(huì)導(dǎo)致創(chuàng)面污染[7]，加之其以生物膜作為天然“避風(fēng)港”，以往檢測不能突破生物膜屏障，導(dǎo)致感染細(xì)菌的種類很難被檢測出。為此，越來越多的研究人員開始探索、使用新穎、高效的檢測手段，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、激光共聚焦掃描技術(shù)（CLSM）、熒光原位雜交技術(shù)（FISH）以及分子檢測技術(shù)等[8]。②細(xì)菌生物膜難以被清除，再生能力很強(qiáng)。其原因主要是：其一，細(xì)菌以附著于傷口表面為生，并以創(chuàng)面為營養(yǎng)來源；其二，細(xì)菌通過與細(xì)胞外基質(zhì)混合、處于休眠狀態(tài)的方式形成抵抗抗菌藥物作用的防御屏障，致使普通抗菌藥物不能有效殺滅細(xì)菌[9-10]。

3 慢性傷口細(xì)菌生物膜去除方法

3.1 物理機(jī)械清創(chuàng)方法 有效清除細(xì)菌生物膜的第1 步是徹底、有效的手術(shù)清創(chuàng)[11]，即用手術(shù)刀清除異物和愈合不良組織，暴露干凈創(chuàng)面，切除已經(jīng)失活的組織、腐肉以及壞死組織，甚至一些竇道，讓傷口徹底變?yōu)樾迈r傷口，保留組織活性[12]。清創(chuàng)不及時(shí)以及細(xì)菌生物膜殘留都會(huì)引起多菌種細(xì)菌定植，導(dǎo)致二次感染，影響愈合[13]。水刀（超聲霧化水流技術(shù)）的核心技術(shù)是液體噴射，高速霧化水流可快速清除細(xì)菌生物膜，創(chuàng)面環(huán)境濕潤潔凈，病人感受良好，屬于無痛清創(chuàng)。Caputo等[14]采用水刀無痛清創(chuàng)對潰瘍病人實(shí)施治療，結(jié)果顯示：超聲霧化水流技術(shù)高效、安全、操作簡單、快速，其與手術(shù)清創(chuàng)比較，清創(chuàng)花費(fèi)時(shí)間較短，手術(shù)速度較快，并且耗材量較少，舒適度較好。

3.2 封閉負(fù)壓引流技術(shù) 程海濤等[15]對于慢性傷口的治療方法進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：封閉負(fù)壓引流技術(shù)聯(lián)合濕性愈合與常規(guī)換藥以及傳統(tǒng)濕性愈合比較，病人傷口愈合比例較高，創(chuàng)面修復(fù)較快，滲液pH 值較低，換藥次數(shù)及醫(yī)療花費(fèi)較少。原因可能是封閉的濕潤環(huán)境適合傷口愈合，也利于肉芽組織生長；同時(shí)，在封閉環(huán)境下及早運(yùn)用封閉負(fù)壓引流，可以保持創(chuàng)面清潔，避免細(xì)菌感染；此外，負(fù)壓狀態(tài)下及時(shí)進(jìn)行流水沖洗和抽吸，可以及時(shí)清除傷口滲出液及壞死組織，細(xì)菌繁殖失去有利條件，有利于傷口快速愈合。封閉負(fù)壓引流技術(shù)一方面為慢性傷口治療提供了有效選擇，另一方面也存在一定弊端，如可能導(dǎo)致肉芽組織過度增生，病人瘢痕情況較明顯。隨著醫(yī)療水平不斷提高以及材料學(xué)發(fā)展，封閉負(fù)壓引流技術(shù)逐漸被應(yīng)用于大部分急診創(chuàng)傷以及部分難愈性傷口，在復(fù)雜的環(huán)境下，醫(yī)務(wù)人員還應(yīng)進(jìn)行針對性的抗感染治療，注意不能過度使用抗感染藥物，以防發(fā)生耐藥性風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 化學(xué)藥物預(yù)防

3.3.1 抗生素 不恰當(dāng)?shù)氖褂每股貢?huì)促使細(xì)菌生物膜形成[16]；同時(shí)，慢性傷口細(xì)菌生物膜形成后，其對抗菌藥物的防滲透會(huì)限制抗菌藥物與細(xì)菌大面積接觸，從而使藥效只能發(fā)揮65%～70%，造成細(xì)菌耐藥性提高上千倍[17]。故臨床治療感染時(shí)應(yīng)綜合考慮以選擇最優(yōu)抗生素。清除生物膜作用效果較好的抗生素分別是氟喹諾酮類、亞胺培南；對細(xì)菌細(xì)胞外多糖基質(zhì)滲透較好的是大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類、頭孢他啶、氨基糖甙類[18]。多菌種導(dǎo)致的細(xì)菌生物膜治療方案以聯(lián)合用藥為主，如頭孢類用藥搭配克拉霉素可直接破壞細(xì)菌生物膜，用藥3 d 后可殺死金黃色葡萄球菌，預(yù)防感染[19]。

3.3.2 含銀敷料 含銀敷料是去除細(xì)菌生物膜，促進(jìn)慢性傷口愈合過程中首推的廣譜抗菌敷料，高濃度銀離子敷料（5～10 g/mL)作用于傷口1～2 d，細(xì)菌生物膜內(nèi)的細(xì)菌會(huì)被基本殺死[20]，可能是由于銀離子不僅可以將細(xì)菌和氧氣、養(yǎng)分隔絕，阻止代謝毒素釋放，還可以局部抗感染，降低創(chuàng)面中細(xì)菌的擴(kuò)展水平，加速傷口愈合[21]。含銀敷料材質(zhì)具有彈性，故有效固定于創(chuàng)面尤為重要。

3.3.3 碘 碘可以有效殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，但其直接作用于傷口會(huì)有細(xì)胞毒性且可能造成病人不舒適[22]。

3.4 生物療法 蛆蟲療法(MDT)是在傷口處放無菌醫(yī)用蛆蟲，利用其生物功能，消化、吸收壞死組織碎片和腐肉，從而去除細(xì)菌賴以生存的基床，搶奪細(xì)菌營養(yǎng)源，減緩細(xì)菌繁殖速度，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而使傷口通過自身免疫愈合[23]。蛆蟲只消化、吸收腐肉，對正常細(xì)胞無危害；同時(shí)，它還可以爬至傷口深部竇道蠶食細(xì)菌生物膜最易形成的部位；此外，蛆蟲可分泌多種蛋白酶以及抗菌酞，分泌物能將腐肉分解成半液狀，加快蛆蟲第2 輪蠶食，最終殺滅、降解細(xì)菌[24]。極具創(chuàng)意的蛆蟲清除生物膜的方案，必須深挖其機(jī)制研究，以更好地指導(dǎo)臨床[25]。

3.5 其他 2000 多年前蜂蜜就開始用于覆蓋、治療潰爛傷口，研究顯示：蜂蜜可殺死大部分細(xì)菌，如革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、需氧菌、厭氧菌等，其療效顯著，愈合速度較快[26]。無菌蜂蜜去除細(xì)菌生物膜可能是由于其高糖、高滲透力可以直接突破生物膜屏障[27]。值得注意的是，蜂蜜可以滅菌，并不意味著任何蜜蜂采的蜂蜜效果均顯著，一般深山地區(qū)較好，這可能與所采蜜內(nèi)含有植物素有關(guān)。隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，植物素滅菌也成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[28]。

4 慢性傷口愈合過程中涉及的因子

慢性傷口細(xì)菌生物膜被去除后，各種炎性因子會(huì)在傷口處呈現(xiàn)高表達(dá)，免疫應(yīng)答一旦被激活，創(chuàng)面即可快速愈合。

4.1 Toll 受體（TLR） TLR 作為對抗抗原和自身異常的候選基因[29]，可以快速識別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)[30]，其高表達(dá)可快速識別細(xì)菌感染，激活天然免疫反應(yīng)，促進(jìn)傷口愈合。其中，TLR 家族中的TLR2專門識別革蘭陽性菌成分和細(xì)菌脂蛋白脂胞壁酸，其與TLR6 混合共同識別革蘭陰性菌成分、酵母多糖、肽聚糖、支原體脂蛋白；TLR4 是機(jī)體對脂多糖(Lipopolysaccharide-LPS)應(yīng)答(革蘭陰性菌)的關(guān)鍵受體[31-32]。此外，TLR 高表達(dá)也可激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[33]，刺激與免疫相關(guān)的因子，引起明顯的炎癥反應(yīng)，尤其是腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)促炎細(xì)胞因子是炎癥反應(yīng)表達(dá)最高的因子。

4.2 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF) MIF 是炎癥介質(zhì)，被各種系統(tǒng)和組織中的細(xì)胞廣泛表達(dá)。丘腦-垂體軸調(diào)節(jié)MIF 分泌，糖皮質(zhì)激素也可控制其釋放水平以及合成數(shù)量[34]。研究表明：MIF 是促炎因子，是先天免疫和后天免疫的重要調(diào)節(jié)因子，其可以通過促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生和負(fù)性調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素的抗炎作用來影響機(jī)體免疫反應(yīng)[35]。MIF 分泌增加可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌其他促炎因子，并以自分泌和旁分泌方式激活T 淋巴細(xì)胞，從而加劇炎癥反應(yīng)；同時(shí)，MIF 也可抑制與糖皮質(zhì)激素相關(guān)的抗炎和免疫反應(yīng)，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)。

4.3 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) VEGF 是一種可調(diào)節(jié)生成新生血管的糖基化分泌性多肽[36]，主要功能是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、趨化細(xì)胞移動(dòng)以及增加血管通透性、誘導(dǎo)血漿蛋白溶酶原激活物和血漿溶酶原激活抑制劑-1 等從而改變細(xì)胞外基質(zhì)，使其更易于血管生長，其活性較強(qiáng)、專屬性較高，在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分裂和運(yùn)動(dòng)的同時(shí)，可增加血管通透性[37]。臨床可通過檢測VEGF 在創(chuàng)面的表達(dá)情況判斷創(chuàng)面愈合狀況，VEGF 轉(zhuǎn)錄和分泌在部分和全層皮膚傷口中提高，則說明創(chuàng)面正在愈合[38]。

4.4 表皮細(xì)胞生長因子（EGF） EGF 可通過信號傳導(dǎo)引起細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)，啟停細(xì)胞分裂相關(guān)基因，使靜止細(xì)胞快速進(jìn)入細(xì)胞分裂期，以達(dá)到細(xì)胞增殖的目的。首先，EGF 作為一種生長因子，具有對炎性細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的選擇性以及迫使其趨向聚集的作用，它可以提高細(xì)胞遷移數(shù)量，迫使細(xì)胞朝創(chuàng)傷部位移動(dòng)。其次，EGF 作為有絲分裂刺激源，可以加速細(xì)胞分裂，促進(jìn)細(xì)胞增殖[39]。再次，EGF 還可以刺激細(xì)胞間質(zhì)快速合成，刺激血管快速生成，促使肉芽組織爬生，最終使創(chuàng)傷達(dá)到修復(fù)、愈合的狀態(tài)[40]。從機(jī)制來看，一方面，EGF 作為皮膚自帶物質(zhì)，通過多種、多層次磷酸化，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)增加的目的；另一方面，EGF 可通過活化糖酵解作用增強(qiáng)呼吸代謝頻率，它可激活磷酸果糖激酶，激活核糖核酸（RNA）轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)蛋白質(zhì)與脫氧核糖核酸（DNA）的合成，最終使表皮細(xì)胞增殖分化[41]。

4.5 成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF2） FGF2 是多功能細(xì)胞生長因子，可以促進(jìn)細(xì)胞間有關(guān)基質(zhì)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞[42-43]、成纖維細(xì)胞的DNA 合成以及細(xì)胞分化、增殖，還可以重建新毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)，加速傷口愈合[44-45]。同時(shí)，F(xiàn)GF2 也能增強(qiáng)炎性細(xì)胞殺菌能力，利于傷口的全面修復(fù)[46]。此外，F(xiàn)GF2 還可避免瘢痕形成。研究表明：創(chuàng)面愈合初期成纖維細(xì)胞數(shù)量會(huì)急劇增加，但隨著成纖維細(xì)胞達(dá)到峰值，F(xiàn)GF2 在傷口中的表達(dá)降低，敏感度下降，肉芽組織生長減慢[47]，過多的膠原降解，瘢痕形成減少。

5 小結(jié)

去除細(xì)菌生物膜是慢性傷口治療、護(hù)理研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容，本研究從細(xì)菌生物膜形成機(jī)制、特點(diǎn)、去除方法以及生物膜去除后傷口相關(guān)因子表達(dá)方面進(jìn)行綜述，旨在為制定慢性傷口治療方案提供科學(xué)的理論依據(jù)。但本研究只介紹了目前使用頻率較多的與細(xì)菌生物膜相關(guān)的慢性傷口治療方案，基于臨床實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)成果納入不足，研究者在以后研究中還需進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍，深化研究內(nèi)容。