環狀RNA-1565對前列腺癌PC-3細胞生物學行為的影響及其機制

時浩清，訾曉淵，張春雷，楊琦，孫穎浩

(海軍軍醫大學附屬長海醫院，上海200433)

前列腺癌在男性癌癥發病率中占第3位，病死率占第6位[1,2]，其發生、發展及轉移的相關機制尚未明了。環狀RNA(circRNA)是一類由線性RNA前體的5′端和3′端共價相連形成的、具有閉合環狀結構特點的非編碼RNA[3]，在基因的轉錄后調控中發揮重要作用。目前大部分circRNA包含若干個miRNA結合位點，具有miRNA海綿的功能，是一種新型的競爭性內源RNA。也有研究顯示，circRNA可與U1 snRNP、RNA聚合酶Ⅱ等蛋白相互作用，參與調控親本基因的表達[4,5]。本課題組前期實驗結果顯示，circRNA-1565在前列腺癌PC-3細胞中的表達顯著升高。2017年5月～2018年5月，本研究觀察了circRNA-1565對前列腺癌PC-3細胞生物學行為的影響，并探討其可能的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：前列腺癌PC-3細胞、人腎上皮293T細胞均購自美國ATCC細胞庫，并培養于海軍軍醫大學附屬長海醫院泌尿外科實驗室。主要試劑：FBS、培養液均購自美國Gibco公司，siRNA分子由上海吉瑪公司設計合成，Mir-X miRNA反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，RNA酶購自美國Invitrogen公司，Lipofectamine2000?購自美國Thermo Fisher公司，小鼠抗人磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)、蝸牛家族轉錄抑制子1(SNAIL1)、β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體均購自美國CST公司。

1.2 circRNA-1565對PC-3細胞生物學行為影響的觀察

1.2.1 circRNA-1565小干擾RNA(siRNA)篩選 采用實時熒光定量PCR法。PC-3細胞采用含10%FBS、1%青-鏈霉素的F12培養液，使用25 cm2細胞培養瓶，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，根據細胞生長狀況,2～3 d更換1次培養基。設計兩條不同的siRNA(si445、si446)，待PC-3細胞融合至約90%時，分別將其轉染進PC-3細胞。轉染48 h后進行細胞總RNA抽提，紫外分光光度計檢測其濃度及純度合格，反轉錄后使用Step One Plus實時定量PCR儀進行PCR反應。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算干擾效率。結果顯示，si445與si446的干擾效率均在80%以上，均符合實驗要求，本研究選擇si445進行后續實驗。

1.2.2 細胞分組處理 將PC-3細胞分為觀察組和對照組，分別轉染si445和陰性對照siRNA，轉染24 h。

1.2.3 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。待PC-3細胞融合至50%～80%時，消化細胞后制成單細胞懸液，密度為1×105/mL。取100 μL細胞懸液接種于96孔板。參照1.2.2進行細胞分組處理，轉染48 h。每孔加入10 mg/mL CCK-8溶液10 μL、新鮮培養液100 μL，37 ℃、5% CO2培養箱中培養2 h。采用酶標儀檢測450 nm波長處的光密度值(OD450)，連續檢測5 d。

1.2.4 細胞克隆形成能力觀察 采用克隆形成實驗。取轉染24 h的兩組細胞，消化細胞后制成單細胞懸液。取細胞懸液接種于6孔板，調整細胞密度為1×102/孔，培養箱中培養7～14 d，每隔3 d進行換液并觀察細胞狀態，直到絕大多數細胞出現大于50的克隆數。吸棄培養皿內溶液，使用甲醛固定細胞30～60 min。吸去固定液，PBS沖洗2次，加入Giemsa染液500 μL進行染色，計數兩組克隆形成個數。

1.2.5 細胞凋亡能力觀察 采用流式細胞術。取轉染24 h的兩組細胞，胰酶消化細胞后重懸，取100 μL單細胞懸液，加入5 μL AV-FITC，室溫避光10 min。每管加100 μL的上樣緩沖液及5 μL PI，輕輕混勻細胞。上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。待PC-3細胞融合至80%～90%時接種于6孔板，參照1.2.2進行細胞分組處理，轉染24 h。用無菌10 μL槍頭垂直培養器底部勻力劃線，更換含有1%血清的新鮮培養液，37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。培養0、12 h于固定位置取樣，計算細胞移動距離。

1.2.7 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實驗。待PC-3細胞融合至50%～80%時，消化細胞后制成單細胞懸液，按照1×105/mL接種于24孔板。參照1.2.2進行細胞分組處理，轉染24 h。用微量移液管將200 μL單細胞懸液加入直徑為8 μm的24孔板Transwell上室中，下室加入500 μL含FBS的培養基，放入恒溫恒濕培養箱中培養24 h。輕輕拂去上室中的細胞，0.1%結晶紫溶液進行染色，計數進入下室的細胞個數。

1.3 與circRNA-1565結合的miRNA篩選 采用免疫共沉淀實驗。將生物素標記的探針和非特異性空白對照探針按200 mmol/L轉染293T細胞，轉染24 h后收集細胞。甲醛固定，加入1 mL裂解液，刮取細胞并靜置10 min。超聲處理樣品，10 000 r/min離心10 min，上清轉移至2 mL離心管中。將帶鏈霉親和素標記的磁珠M-280充分混勻，分裝至1.5 mL EP管中，每管100 μL，用RNase-free的BSA和酵母tRNA進行包被。將所獲得上清與預處理的磁珠混合，加入200 μL裂解液進行重懸，放置2 h進行解交聯。結果顯示，circRNA-1565的探針能夠富集miRNA 87條(fold>2)，其中顯著上調的有28條(fold>10)。結合TargetScan[6,7]和Miranda[8,9]生物信息學數據庫的注釋，選擇miR-21和miR-153進行后續研究。

1.4 circRNA-1565對miR-21和miR-153的調控作用觀察 采用雙熒光素酶報告基因實驗。將circRNA-1565的miRNA結合位點序列克隆到報告基因質粒的R-Luc 3′UTR區，構建熒光素酶報告基因質粒。將能夠表達miR-21和miR-153的前體序列分別克隆到過表達質粒pEX-3中，構建pEX-miR-21過表達質粒、pEX-miR-153過表達質粒。利用Lipofectamine2000?將pEX-miR-21過表達質粒、pEX-miR-153過表達質粒、pEX-miR-21+pEX-miR-153過表達質粒及陰性對照質粒pEX-NC分別與熒光素酶報告基因質粒共同轉染293T細胞，每組6個復孔。轉染48 h后裂解細胞，加入F-Luc底物檢測熒光強度，再加入R-Luc底物檢測熒光強度，以后者與前者熒光強度的比值計算報告基因活性。

1.5 miR-21、miR-153對circRNA-1565干擾的PC-3細胞侵襲、遷移能力影響的觀察 將PC-3細胞分為si445組、si445+miR-21 inhibitor組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組，分別轉染si445、si445+miR-21 inhibitor、si445+miR-153 inhibitor及陰性對照siRNA，參照1.2.6和1.2.7的方法分別觀察細胞遷移、侵襲能力。

1.6 細胞PI3K、PTEN、SNAIL1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將PC-3細胞隨機分為si445組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組，分別轉染si445、si445+miR-153 inhibitor、陰性對照siRNA。轉染24 h加入細胞裂解液150 μL，進行SDS-PAGE電泳，置入轉膜夾，以300 mA恒定電流轉膜1.5 h。將PVDF膜取出，標記正面，置入封閉液中，置于平板蕩器上，室溫封閉2 h。加入PI3K、PTEN、SNAIL1、β-actin一抗(稀釋比例分別為1∶750、1∶750、1∶500、1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入二抗(稀釋比例均為1∶2 000)，室溫孵育2 h。DBA顯色，采用BioRAD凝膠成像系統進行曝光， Image J軟件分析條帶灰度值。以β-actin為內參，以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值計算PI3K、PTEN、SNAIL1蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 兩組生物學行為相關指標比較 觀察組與對照組不同時間點OD450、克隆形成個數、細胞凋亡率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。觀察組進入下室的細胞個數、細胞移動距離均低于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組生物學行為相關指標比較

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.2 circRNA-1565對miR-21和miR-153的調控作用 轉染pEX-miR-21過表達質粒、pEX-miR-153過表達質粒、pEX-miR-21+pEX-miR-153過表達質粒與陰性對照質粒pEX-NC的293T細胞報告基因活性分別為0.43±0.11、0.49±0.10、0.21±0.06、1.00±0.07，轉染陰性對照質粒pEX-NC的293T細胞報告基因活性高于轉染其他質粒的293T細胞(P均<0.05)。

2.3 si445組、si445+miR-21 inhibitor組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組細胞侵襲、遷移能力比較 si445組、si445+miR-21 inhibitor組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組進入下室的細胞個數分別為(77±7)、(97±6)、(174±8)、(212±8)個，細胞移動距離分別為(1.0±0.1)、(1.4±0.1)、(2.8±0.3)、(3.1±0.2)μm；與陰性對照組比較，其余三組進入下室的細胞個數、細胞移動距離均降低，且si445組、si445+miR-21 inhibitor組降低更明顯(P均<0.05)。si445組、si445+miR-21 inhibitor組進入下室的細胞個數、細胞移動距離比較P均>0.05。

2.4 si445組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組細胞PI3K、PTEN和SNAIL1蛋白表達比較 si445組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組細胞PI3K蛋白相對表達量依次升高(P均<0.05)，三組細胞PTEN和SNAIL1蛋白相對表達量比較P均>0.05。見表2、圖1。

表2 三組細胞PI3K、PTEN和SNAIL1蛋白相對表達量比較

注：與陰性對照組比較，*P<0.01；與si445+miR-153 inhibitor組比較，#P<0.05。

3 討論

我國前列腺癌患者發現時多處于晚期，且多存在遠處轉移[10]。前列腺癌遠處轉移部位包括骨、肺和肝臟等，其遠處轉移的機制尚未完全闡明，但可以肯定其轉移是多種復雜分子網絡調節異常的結果[11]。近年來，RNA-Seq等研究手段日漸成熟，非編碼RNA的作用逐漸得到重視，并發現了一種新的內源性非編碼RNA類型——circRNA。circRNA是一類具有閉合環狀結構特點的非編碼RNA[3]，具有穩定性、組織細胞發育的時空特異性以及保守性等生物學特性，在基因調控過程中具有重要作用[12,13]。circRNA并不是細胞中的“剪切副產物”，而是細胞內不可或缺的部分，具有重要的生物學功能。circRNA與多種腫瘤的發生、發展密切相關[14～19]，并有望成為腫瘤的新型生物標志物甚至治療靶點，但其在前列腺癌中的研究甚少。本課題組在前期研究中對前列腺癌細胞RNA抽提并質檢后進行circRNA測序，成功鑒定出差異表達的circRNA共300余條，其中上調表達的有85條；根據PCR檢測結果，結合circBase等公共數據庫的注釋以及既往相關研究，最終選定circRNA-1565作為研究對象，并證實其在轉移性前列腺癌細胞系中表達量高，在非轉移性前列腺癌細胞系中表達量低，在前列腺正常細胞系中表達量極低。

注：A為陰性對照組，B為si445組，C為si445+miR-153 inhibitor組。

圖1三組細胞PI3K、PTEN和SNAIL1蛋白表達情況(Western blotting法)

siRNA是最方便和廣泛的一種人工合成下調目的基因表達方式，其作用在mRNA和LncRNA的研究中得到有效驗證。但對circRNA而言，由于其空間結構相對復雜，siRNA的效果很難保證。為了避免脫靶效應，circRNA的siRNA必須靶向設計在接頭部位，否則就會造成假陽性。因此，本研究設計了兩條不同的siRNA(si445、si446)，其干擾效率均在80%以上，均符合實驗要求，選擇si445進行后續實驗。本研究結果顯示，觀察組細胞移動距離明顯短于對照組，進入下室的細胞個數少于對照組，但兩組細胞OD450、克隆形成個數及細胞凋亡率比較均無明顯差異；這說明circRNA-1565可促進前列腺癌細胞的侵襲與遷移，但不能影響前列腺癌細胞的增殖與凋亡。

本研究雙熒光素酶報告基因結果顯示，過表達miR-21、miR-153可通過結合circRNA-1565來抑制報告基因熒光素酶活性，說明circRNA-1565可以分別與miR-21和miR-153直接結合，即circRNA-1565可以通過競爭性結合miR-21和miR-153來發揮相應的生物學作用。本研究結果顯示，miR-153 inhibitor可以促進circRNA-1565干擾的PC-3細胞侵襲與遷移，而miR-21 inhibitor的效果則不明顯；說明miR-153參與了circRNA-1565介導的前列腺癌細胞侵襲與遷移，而miR-21雖然也可被circRNA-1565調控，但并不參與其介導的前列腺癌細胞侵襲與遷移。通過查閱TargetScan和Miranda等生物信息學數據庫對miR-153的注釋，并結合既往研究證據，選定miR-153有PI3K、PTEN、SNAIL1等幾個下游靶點。PI3K目前已知對細胞的增殖、分化、凋亡均有影響，是一種主要的穩態調節因子，通過下調PI3K/AKT/mTOR信號通路可抑制多種細胞再生過程。本研究結果表明，si445組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組細胞PI3K蛋白相對表達量依次升高，三組細胞PTEN和SNAIL1蛋白相對表達量比較無統計學差異；這說明circRNA-1565可通過沉默miR-153來調控下游靶蛋白PI3K表達，該調控機制與PTEN、SNAIL1蛋白無關。

綜上所述，circRNA-1565可促進前列腺癌PC-3細胞侵襲和遷移，其機制可能與競爭性結合miR-153并沉默其下游靶蛋白PI3K表達有關。