原發性肝細胞癌組織中LAP+CD4+ T細胞比例變化及其與患者臨床病理特征的關系

蔣春艷，陳木興，謝麗平，林濤發，王少揚

(1蚌埠醫學院福總教學醫院，福州350000；2中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院)

原發性肝細胞癌(HCC)被列為全世界癌癥相關死亡的第二大原因，我國HCC發病及死亡人數在全世界范圍內占比均為50%左右[1]。當肝細胞發生癌變時，癌周結構和細胞群體均發生改變，這種惡性細胞與周圍非惡性基質之間的結構成分和動態相互作用被稱為腫瘤微環境[2]。免疫細胞分布和功能異常是HCC發生和發展的重要機制，也是HCC微環境改變的主要特征。調節性T細胞(Tregs)是腫瘤微環境中的重要免疫調節成分，具有獨特的免疫抑制能力，可以削弱機體的抗腫瘤能力，協助腫瘤細胞完成免疫逃逸[3]。LAP+CD4+T細胞是新發現的一種Tregs亞群[4]，具有比經典CD4+CD25+Foxp3+T細胞更強的腫瘤抑制活性[5]。有研究表明，LAP+CD4+T細胞具有比LAP-CD4+T細胞更高的腫瘤組織歸巢傾向，提示LAP+CD4+T細胞可能參與了腫瘤的發生與發展[6]。但是關于LAP+CD4+T細胞比例在HCC腫瘤微環境中的變化及臨床意義鮮有報道。為此，本研究觀察了HCC患者癌組織中LAP+CD4+T細胞比例變化，并分析其與患者臨床病理參數的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年12月～2018年10月于中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院進行初次手術治療的HCC患者30例，男22例、女8例，年齡27～71歲，血清甲胎蛋白(AFP)<200 ng/mL 16例，≥200 ng/mL 14例；AST/ALT<1.0 17例，≥1.0 13例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期9例。患者均經術后病理確診為HCC，排除接受過靶向藥物治療、射頻消融、經導管動脈化療栓塞及免疫治療等抗腫瘤治療的患者，合并自身免疫性疾病的患者。本研究通過中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院倫理委員會審核，患者均簽署知情同意書。

1.2 組織LAP+CD4+T細胞比例檢測 選取患者術中切除的新鮮癌組織及距腫瘤2 cm處相應的癌旁組織(大小約為2 cm×1 cm×1 cm)，去除壞死組織、脂肪及其他正常組織。眼科剪剪碎，置入配制好的組織消化液中，37 ℃條件下恒溫震蕩消化1 h。70 μm一次性細胞濾網濾過，將濾液吸至15 mL離心管中，25 ℃條件下1 500 r/min離心10 min，吸去上層清液，沉淀中加入PBS 4 mL重懸，制備細胞懸液。各取100%和75% ficoll-hypaque淋巴分離液(北京索萊寶生物有限公司)2 mL，依次緩慢加至另一個15 mL離心管中，于最上層加入細胞懸液4 mL，25 ℃條件下2 000 r/min離心35 min，一次性無菌吸管收集100%和75% ficoll-hypaque淋巴分離液之間的云霧狀細胞層。加入PBS 3 mL，1 500 r/min離心10 min，25 ℃條件下洗滌2次。加入1%BSA重懸，調整細胞密度為2×106/mL。每份標本各取出100 μL分裝于2個EP管中，標記為實驗管與同型對照管。暗室條件下各取5 μL抗CD4、抗LAP抗體(美國eBioscience公司)加入實驗管，同型對照管加入相應同型抗體，暗室中室溫孵育40 min。加入PBS 500 μL，25 ℃條件下2 000 r/min離心6 min，棄上清后重懸。上流式細胞儀(美國BD公司)檢測LAP+CD4+T細胞比例占總CD4+T細胞的百分比，即為LAP+CD4+T細胞比例。分析癌組織LAP+CD4+T細胞比例與患者臨床病理參數的關系。

2 結果

2.1 HCC患者癌組織及癌旁組織中LAP+CD4+T細胞比例比較 HCC患者癌組織及癌旁組織中LAP+CD4+T細胞比例分別為11.57%±1.59%、5.74%±0.89%，兩者比較P<0.01。

2.2 HCC患者癌組織LAP+CD4+T細胞比例與臨床病理參數的關系 HCC患者癌組織LAP+CD4+T細胞比例與性別、年齡、血清AFP水平及AST/ALT均無關(P均>0.05)，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的HCC患者癌組織LAP+CD4+T細胞比例低于Ⅲ～Ⅳ期患者(P<0.05)。見表1。

表1 HCC患者癌組織LAP+CD4+ T細胞比例與臨床病理參數的關系

3 討論

免疫逃逸是正常細胞轉化為惡性細胞，以及惡性細胞隨后存活所必需的關鍵機制。免疫系統可以通過一種叫做免疫編輯的復雜機制來促進癌細胞的形成[7]。在清除階段，轉化后的細胞可以被免疫細胞(如細胞毒T淋巴細胞和自然殺傷細胞)破壞;但在平衡階段，腫瘤細胞可降低其免疫原性，以逃避免疫殺傷機制，最終在逃逸期形成腫瘤。肝臟通過門靜脈不斷暴露在各種高水平的抗原中，肝臟微環境表現為強大的免疫抑制作用，以防止自身免疫性肝損傷的發生[9]。在肝臟免疫微環境中，Tregs和髓源性抑制細胞等免疫調節細胞發揮抑制免疫反應作用，從而促進肝臟腫瘤的發生[8]。鑒于肝臟特殊的免疫環境，臨床上需要充分研究肝臟腫瘤微環境中免疫成分的改變，從而進一步明確免疫成分在產生抗腫瘤免疫應答過程中所發揮的作用。

研究表明，HCC患者癌組織浸潤淋巴細胞中Tregs數量增加[10]。一項關于肝癌的研究顯示，通過抑制Tregs功能可以增強抗腫瘤免疫應答效應[11]。Tregs在HCC患者血液中的比例明顯升高，而Tregs比例與HCC嚴重程度有關[12,13]。此外，與癌旁組織相比，癌組織Tregs大量聚集后伴隨CD8+T細胞數量減少[14]。因此，腫瘤浸潤性Tregs數量增加可能促進了HCC的進展，并有可能與患者預后不良有關。LAP是一種前肽，與TGF-β的氨基末端非共價結合并產生潛伏的TGF-β復合物，從而促進TGF-β1向細胞外基質釋放。此外，潛伏的TGF-β復合物可表達于血小板、樹突狀細胞和Tregs等多種免疫細胞的細胞膜，并參與免疫調節機制[6]。LAP+CD4+T細胞是人外周血中非Foxp3+陽性抑制細胞的一個新子集，在體外可以抑制其他T細胞增殖，其抑制作用可能由TGF-β和IL-10介導[3]。本研究結果顯示，HCC患者癌組織LAP+CD4+T細胞比例升高，癌組織LAP+CD4+T細胞比例與患者的性別、年齡、血清AFP水平及AST/ALT均無關，但TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的患者癌組織LAP+CD4+T細胞比例低于Ⅲ～Ⅳ期患者，說明LAP+CD4+T細胞可能通過其自身免疫抑制性而促進HCC進展。本研究結果顯示，癌組織LAP+CD4+T細胞比例明顯高于癌旁組織，提示LAP+CD4+T細胞具有一定向腫瘤組織歸巢的趨向性;但是,隨著HCC疾病進展，這些細胞是否會在腫瘤微環境中積累并向外周血釋放仍需進一步觀察。

綜上所述，HCC患者癌組織LAP+CD4+T細胞比例升高，且LAP+CD4+T細胞可能參與了HCC的疾病進展。