姜黃素對人表皮角質形成細胞HaCaT增殖、凋亡的影響及其機制

汪五清，曾義斌，張彤，張超，賀燕妮，杜凌波，強燕

(1上海市閔行區中心醫院，上海201199；2上海交通大學醫學院附屬松江醫院)

銀屑病是一種自身免疫性慢性炎癥性疾病，發病機制尚未完全明確，其致死率較低，但是會嚴重降低患者的生活質量[1,2]。銀屑病是以角細胞過度增殖為主要病理變化，因此既往多以人表皮角質形成細胞HaCaT為細胞模型進行基礎研究[3]。姜黃素是一種從姜黃等藥用植物中提取的植物多酚，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和免疫調節等多種作用[4]，臨床上廣泛應用于腫瘤、骨關節炎、脊髓損傷、心血管疾病、糖尿病等疾病的治療，且取得了較好療效[5]。目前關于姜黃素治療銀屑病的研究較少，其作用機制也未闡明。2016年6月～2018年12月，本研究觀察了姜黃素對HaCaT細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：HaCaT細胞購自美國ATCC細胞庫。主要試劑：姜黃素購自美國Sigma公司，DMEM高糖培養基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibico公司;MTS增殖檢測試劑盒購自美國Biovision公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物技術有限公司，細胞周期檢測試劑盒和RIPA裂解液購自碧云天生物科技有限公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Thermo公司，PVDF膜購自索萊寶科技有限公司;血管內皮細胞生長因子(VEGF)抗體orb163157購自英國Biorbyt 公司，細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)抗體ab16663、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗體ab32124、GAPDH抗體ab181602均購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養及分組處理 將HaCaT細胞培養在含10% FBS的DMEM高糖培養基中，置于37 ℃、5% CO2全濕培養箱中。待細胞融合至90%時，按1∶3進行傳代。取對數生長期的HaCaT細胞，隨機分為高、中、低濃度姜黃素組和對照組，高、中、低濃度姜黃素組分別加入終濃度為40、20、10 μmol/L的姜黃素，對照組加入等量培養基。

1.3 細胞增殖能力觀察 采用MTS法。取對數生長期的HaCaT細胞，以2×103/孔接種于96孔培養板中，參照1.2的方法進行分組處理，每組設置6個復孔，并設置空白對照。各組作用48 h，每孔加入30 μL MTS試劑，37 ℃細胞培養箱中孵育2 h。全波長掃描儀獲得490 nm波長處的OD值，細胞增殖抑制率=1-(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.4 細胞克隆形成能力觀察 采用平板克隆實驗。取對數生長期的HaCaT細胞，以3×102/孔接種于6孔培養板中，參照1.2的方法進行分組處理，每組設置3個復孔。各組作用2周待克隆團長出后，終止培養。甲醇固定細胞，結晶紫染色，記錄克隆形成數。實驗重復3次，取平均值。

1.5 細胞凋亡能力觀察 采用流式細胞術。取對數生長期的HaCaT細胞，以6×105/孔接種于6孔培養板中，參照1.2的方法進行分組處理，每組設置3個復孔。各組作用48 h，加入無EDTA的胰酶消化收集細胞，PBS沖洗3次，重懸于500 μL Binding Buffer中。分別加入5 μL FITC和PI染液，37 ℃條件下避光孵育30 min。上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次，取平均值。

1.6 細胞周期比例檢測 采用流式細胞術。取對數生長期的HaCaT細胞，以6×105/孔接種于6孔培養板中，參照1.2的方法進行分組處理，每組設置3個復孔。各組作用48 h，加入胰酶消化收集細胞，PBS沖洗3次后，重懸于500 μL染色緩沖液中。分別加入250 μL PI和10 μL RNaseA染液，37 ℃條件下避光孵育30 min。上流式細胞儀檢測細胞周期比例。實驗重復3次，取平均值。

1.7 VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取對數生長期的HaCaT細胞，以5×106/孔接種于10 cm3培養皿中，參照1.2的方法進行分組處理，每組設置3個復孔。各組作用48 h，胰酶消化收集細胞，PBS沖洗3次，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA。超聲裂解30 min，4 ℃條件下14 000 r/min離心20 min。BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性后冷卻，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白。350 mA濕轉轉膜120 min，TBST沖洗后5% BSA室溫封閉2 h。分別加入VEGF、Cyclin D1、Bcl-2及內參蛋白GAPDH一抗(稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST沖洗3次;加入二抗(稀釋比例均為1∶10 000)，室溫孵育2 h。ECL化學發光法曝光條帶，采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值計算VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率、克隆形成數、細胞凋亡率比較 高、中、低濃度姜黃素組和對照組細胞增殖抑制率、細胞凋亡率均依次降低，克隆形成數依次升高，兩組間比較P均<0.05。見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率、克隆形成數、細胞凋亡率比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與低濃度姜黃素組比較，#P<0.05；與中濃度姜黃素組比較，△P<0.05。

2.2 各組細胞周期比例比較 高濃度姜黃素組G0/G1期細胞比例均高于中、低濃度姜黃素組和對照組，G2/M期細胞比例均低于中、低濃度姜黃素組和對照組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細胞周期比例比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與低濃度姜黃素組比較，#P<0.05；與中濃度姜黃素組比較，△P<0.05。

2.3 各組細胞VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達比較 高、中、低濃度姜黃素組和對照組細胞VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白相對表達量均依次升高，兩組間比較P均<0.05。見表3。

表3 各組細胞VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與低濃度姜黃素組比較，#P<0.05；與中濃度姜黃素組比較，△P<0.05。

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，以紅色斑塊上覆蓋銀白色鱗片為主要特征，最常發病于皮膚、指甲和關節等部位[2]。銀屑病病情頑固，復發率高，臨床上缺乏有效的治療手段[6]。銀屑病男女發病率無明顯區別，但是具有遺傳性，35%～90%的銀屑病患者有家族史[1]。目前銀屑病的發病原因不明，炎癥細胞彌漫浸潤、角質形成細胞過度增殖以及新生血管形成是銀屑病的特征性病理表現，在臨床上主要通過恢復角化細胞、止癢、調節免疫和靶向藥物等方法治療銀屑病，但是效果并不理想[2]。

姜黃素屬于植物多酚，是一種稀有的二酮色素，主要從姜科植物的根莖中提取，為橙黃色粉末，多用于醬鹵制品、罐頭等食品的著色。近年來發現姜黃素除了傳統用途，還具有藥用價值，主要的藥理作用包括減輕炎癥反應、抗氧化反應、抗腫瘤、抗纖維化、調節免疫、降糖和降脂等[4]。姜黃素屬于天然產物，安全性較高，不良反應小，在臨床上可用于治療多種疾病[5,6]。研究表明，姜黃素可抑制結直腸癌細胞的增殖分化，并促進細胞凋亡[7,8]。銀屑病是T細胞介導的自身免疫性炎癥性疾病[9]，目前，關于姜黃素是否可以抑制銀屑病的進展鮮見報道。本研究結果顯示，姜黃素可抑制HaCaT細胞增殖、促進其凋亡，并呈濃度相關性。細胞周期與細胞增殖密切相關，Cyclin D1是細胞周期的正調控因子，可促使細胞由G0/G1期進入S期，從而進行有絲分裂、促進細胞增殖[10]。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，在正常狀態下Bcl-2不表達或者表達較低，在增殖細胞內Bcl-2過度表達而拮抗細胞凋亡，使細胞維持在長期存活的狀態[11,12]。本研究結果顯示，姜黃素可將HaCaT細胞阻滯于G0/G1期，并抑制HaCaT細胞中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達，且呈濃度相關性；這說明姜黃素抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的機制可能與抑制Cyclin D1、Bcl-2表達，從而使細胞阻滯于G0/G1期有關。

銀屑病是一種復雜的多因素疾病，表現為表皮細胞生長、分化以及多種免疫因子異常和血管新生，其中異常新生的微血管與銀屑病的發生、發展密切相關，在銀屑病紅斑真皮乳頭層中可見迂曲、擴張的新生微血管[13]。血管異常新生受血管生長因子和抑制因子調控，在正常狀態下兩者維持平衡，當外部刺激時血管生長因子生成增多，可導致血管病理性生成[14]。VEGF是一種重要的促血管生長因子，在銀屑病早期VEGF可促進血管基底膜分解及內皮細胞遷移，銀屑病后期可促進內皮細胞增殖，調節與重構血管新生網絡，在銀屑病的發生、發展中具有重要作用[15]。研究表明，VEGF可參與腫瘤血管新生，在腫瘤的侵襲、轉移等惡性生物學行為中具有重要作用[16,17]。本研究結果顯示，姜黃素處理HaCaT細胞后VEGF蛋白表達降低，并呈濃度相關性；表明姜黃素可能通過抑制VEGF而調控HaCaT細胞的增殖與凋亡，最終參與血管新生。

綜上所述，姜黃素可抑制HaCaT細胞增殖、促進細胞凋亡，并呈濃度相關性，其機制可能與抑制VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達有關。