宏基因組學在感染性疾病診治中的研究進展

王 碩，張志華

(承德醫學院附屬醫院血液內科，河北 承德 067000)

近年來，mNGS正在從實驗室研究發展階段應用于臨床實驗室診斷，改變了臨床醫生診斷和治療感染性疾病和腫瘤以及人類宿主基因表達異常(轉錄組)等各類疾病的方式。mNGS技術是將通用接頭連接到要測序的片段化基因組DNA,然后使用不同的方法產生數千萬的單分子多克隆聚合酶鏈反應陣列,然后進行大規模的引物雜交及酶延伸反應。2005年二代測序(Next-generation sequencing,NGS)技術的出現使宏基因組學迅速發展，這是第一次可以同時對幾十萬甚至幾百萬的讀數進行測序,并且可以同時檢測反應后每個步驟產生的信號,通過計算機分析獲得完整的DNA序列信息以得到臨床或環境樣本的整個遺傳內容[1]，測序成本降低推動了mNGS技術的普及，且因其檢測速度快、準確率高、覆蓋范圍廣等優勢,具有良好的臨床應用發展趨勢，本文就mNGS的臨床微生物學分析、病原體-宿主相互作用研究、腫瘤學和面臨的挑戰等方面進行綜述。

1 臨床宏基因組學的應用

1.1 病原微生物的鑒定：醫學微生物學是研究微生物的形態、結構、分類和社會革命活動規律的一門科學，包括細菌學、病毒學、真菌學等。微生物學的傳統實驗室診斷技術包括培養鑒定、病原體的特異性抗體(血清)或抗原的檢測及其核酸(DNA或RNA)的分子生物學鑒定，目前最常用的檢測方法為PCR和RT-PCR(多聚酶鏈反應)。然而，分子生物學鑒定必須使用特定的引物或探針靶向鑒定特定的病原體，檢測的病原體種類非常有限。宏基因組學可以檢測樣本中所有物種的DNA或RNA，能夠快速分析患者樣品中整體微生物群以及人類宿主基因組和轉錄組，因此，mNGS對于發現新型病原體并檢測健康和患病狀態下的人類具有顯著優勢。

文獻表明目前仍有20%～60%的病例未檢測到致病病原體[2]，基于高通量測序的宏基因組學研究給病原體的識別鑒定帶來了新的方法和思路，mNGS可檢測臨床樣本中病原體的全部基因信息，獲得有關主要抗原和毒力基因，并進行病毒基因分型，實現對新興病原體的識別、分型和溯源。Samarkos等通過全基因組序列的系統發育分析發現中國和美國的COVID-19的分離株聚集在同一系統進化枝中，并發現其與兩種蝙蝠SARS樣冠狀病毒(Bat-SL-CoVZC45和Bat-SL-CoVZXC21)的同源性為86.9%，故判斷其為一種新型冠狀病毒[3]，研究還發現中國和美國COVID-19分離株的基因組序列在核苷酸水平上的同源性高達99.8%至100%，判斷其為同一種冠狀病毒。綜上，基于mNGS對COVID-19的全面分析一定能獲得該病毒的起源、傳播途徑以及物種屏障等相關信息，進而為傳染病的預防、控制提供依據。

1.2 病原微生物組學分析：mNGS正在逐漸取替16S rDNA基因的靶向測序，以實現我們對不同環境微生物組成的檢測鑒定[4]。廣譜抗生素長期大量應用和胃腸外科手術等多種因素導致腸道菌群比例失調，發生感染[5]，嚴重時可導致危及生命的暴發性偽膜性腸炎和中毒性巨結腸。其中治療方法之一為糞便菌群移植，成功率高達80～90%，間接證明微生物組學研究有助于治療艱難梭菌感染[6]。腸道宏基因組相關研究顯示腸道菌群與肥胖、糖尿病、炎癥性腸病等疾病密切相關，通過mNGS鑒定腸道菌群失衡有助于靶向菌群移植治療[7]，此外，通過mNGS分析微生物組的多樣性可以對宿主的健康和疾病狀態進行評估，Boulange等發現不同肺部疾病的肺泡灌洗液具有不同的微生物群落[8]。以微生物為靶點,利用mNGS干預微生物組必將成為臨床治療新的探索方向。

1.3 病原體-宿主相互作用研究:mNGS基因表達分析具有互補作用，通過檢測微生物表達產物的RNA-seq讀數可以把感染、定植和活菌與死菌區別出來[9]，實現了包括葡萄球菌、白色念珠菌、結核和流感的診斷治療[10～12]。基于病原體的特異性宿主反應也可用于診斷復雜感染病例，例如膿腫和呼吸道分泌物等。此外，對于測序結果的二次數據(即結合微生物和宿主基因表達數據)挖掘可提高臨床診斷的準確性。

1.4 在腫瘤學中的應用:在腫瘤發生機制中，mNGS可鑒定與癌癥相關的病毒(包括皰疹病毒、乳頭瘤病毒、肝炎病毒、EB病毒等)和病毒-宿主相互作用的數據[13]。根據病毒感染及其參與的信號通路為靶向抗病毒和(或)化療藥物的使用提供信息[14]，丙型病毒性肝炎通過抗病毒治療后肝癌的風險性降低。目前，臨床mNGS主要應用于晚期腫瘤的用藥指導，多基因、多位點突變的檢測技術較傳統檢測手段具有顯著優勢。此外，腫瘤DNA變異在腫瘤早期或腫瘤負荷較小時便出現于血液中,通過對血液中的游離DNA的檢測可以實現腫瘤的早期診斷或判斷是否疾病進展，mNGS還可用于腫瘤術后的復發監測、診斷微小殘留病灶等，為腫瘤患者的個體化診療提供依據。

2 臨床應用面臨的挑戰

mNGS技術的不斷完善正在推動精準醫學模式的發展，該技術仍存在諸多問題限制其在病原體檢測方面的應用和發展，首先，mNGS的測定結果缺乏重復性和質量保證，而且成本、報銷問題也是臨床mNGS實施的障礙,此外，mNGS的檢測也是一項十分繁復的工作，需要定制質量管理以達到監管目的，另外，不規范的實驗操作也可能引起外源性背景菌的污染從而增加診斷難度，故在臨床應用之前，需進行重復性驗證研究以獲得可信度高的測序結果。

2.1 實驗流程:mNGS檢測前需要嚴格的樣品處理方案以避免錯誤和交叉感染，包括樣品收集、核酸提取、文庫制備等過程，在上述過程中即使微量外源性DNA或RNA混進待測樣本也可被檢測出來從而干擾測序結果，由于樣品處理的輕微偏差都會導致測序結果發生較大差異，所以需要將工作流程分為連續的幾個步驟，工作人員只需負責自己的工作步驟，這樣有助于避免實驗錯誤，此外，背景微生物數據庫(包括mNGS測序過程中檢測到的正常微生物和污染產生的微生物)的建立至關重要，通過排除背景微生物以實現臨床診斷，除此之外，還需要制定參考標準以確保mNGS的測序質量和實驗結果的穩定性。

2.2 生物信息學技術:mNGS在我國臨床感染性疾病的診斷中尚未普及,現有檢測機構的測序方法，不僅生物信息算法存在差異,而且所用的數據庫也有所不同,導致微生物的鑒定以及豐度計算方面均存在差別，為保證臨床mNGS數據的準確性，必須對生物信息分析過程中每個數據處理步驟進行評估分析，包括計算機數據和臨床樣本數據。微生物基因組的公共數據庫包括國家信息中心數據庫(National Center for Information Biotechnology Information,NCBI)和華大基因數據庫，對于目前臨床mNGS應用來說，數據庫的綜合分析和整合更有利于數據的準確性，另外，需要對微生物測序讀數設定閾值以明確具有臨床意義的微生物。

mNGS對于感染性疾病的診治方面具有不可忽略的臨床應用價值，隨著測序技術的發展，mNGS必將成為臨床病原體檢測的常規方法，為實現精準醫療做出貢獻。