LIM激酶及其抑制劑的研究進(jìn)展

黃啟璐，吳愛(ài)兵，楊志雄

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江 524000

目前研究發(fā)現(xiàn)LIM激酶與許多疾病密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也至關(guān)重要，LIMK 不僅與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移密切相關(guān)，還促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞耐藥的發(fā)生，因此，針對(duì)LIM 激酶的藥物研究也成為熱點(diǎn)。本文就LIM激酶及其抑制劑做一綜述。

1 LIMK的結(jié)構(gòu)及功能

LIMK 激酶是一類存在于真核生物中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括LIMK1 和LIMK2 兩個(gè)成員，其編碼基因分別位于人染色體7q11.23 和人類染色體22q12.2。LIM 激酶具有特殊的結(jié)構(gòu)：具有兩個(gè)N-末端的LIM結(jié)構(gòu)域、C-末端的激酶結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域，其整體序列具有50%的同源性，而激酶結(jié)構(gòu)的序列同源性則高達(dá)70%[1-2]。LIM 結(jié)構(gòu)域由一對(duì)富含半胱氨酸/組氨酸序列的鋅指結(jié)構(gòu)域組成，是LIMK與許多大分子相互作用的結(jié)構(gòu)域，在調(diào)節(jié)激酶活性中起重要作用。PDZ 結(jié)構(gòu)域包括兩個(gè)富含亮氨酸的核輸出信號(hào)，促使LIMK1 優(yōu)先定位在細(xì)胞質(zhì)中，而缺失PDZ 結(jié)構(gòu)域的LIMK1 突變體則主要定位在細(xì)胞核中。C-末端激酶部分包含構(gòu)成核定位序列的一段堿性殘基[3]。雖然LIMK1和LIMK2結(jié)構(gòu)相似，兩者表達(dá)部位及亞細(xì)胞定位存在差異。LIMK1 主要表達(dá)于腦組織中，在胚胎和成熟組織以及心臟和骨骼肌中均中等表達(dá)，而LIMK2 在所有組織中廣泛表達(dá)[4-5]。此外，LIMK1 和LIMK2 的亞細(xì)胞定位和功能不同，有研究發(fā)現(xiàn)LIMK1可與高爾基體膜結(jié)合，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白解聚重組，從而調(diào)節(jié)高爾基體中蛋白質(zhì)的運(yùn)輸[6]。

Cofilin 是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，其磷酸化與去磷酸化可調(diào)節(jié)F-actin和G-actin之間的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架活性及肌動(dòng)蛋白相關(guān)細(xì)胞活動(dòng)中產(chǎn)生重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，LIMK1 和LIMK2 均可磷酸化ADF/cofilin 的第3 位絲氨酸(ser3)，磷酸化的cofilin喪失活性，與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合能力下降，F(xiàn)-actin聚合形成偽足，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；而Ser3 位點(diǎn)的去磷酸化又可恢復(fù)cofilin 對(duì)肌動(dòng)蛋白的解聚活性，促進(jìn)F-actin 解聚為G-actin，參與了肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架的重組[7]。LIMK 整合了多種調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合的上游信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)控cofilin 的活性從而影響肌動(dòng)蛋白的穩(wěn)定性，調(diào)控各種細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、分裂以及各種膜結(jié)構(gòu)和其他的微細(xì)結(jié)構(gòu)形成[8-9]，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、細(xì)胞周期及凋亡等生物學(xué)功能產(chǎn)生重要影響。

LIMK主要受GTPase Rho蛋白家族的調(diào)控，Rho、Rac 和Cdc42 蛋白分別通過(guò)激活其下游效應(yīng)激酶ROCK1/2、PAK1/2/4 和MRCKα使LIMK 磷酸化而激活，磷酸化的LIMK 進(jìn)一步使cofilin Ser3 位點(diǎn)磷酸化從而失活[3]。此外，多種miRNA如miR-20a、miR-210、miR-125a-5p等在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)有差異性[10-12]，并可影響細(xì)胞中LIMK 的表達(dá)。miR-138-5p、miR-159d-3p、miR-20a 可通過(guò)抑制LIMK1 的表達(dá)從而抑制乳腺癌細(xì)胞、皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力[13-15]，miR-145 通過(guò)靶向PAK4 抑制LIMK1的表達(dá)，從而調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲遷移[16]。

2 LIMK與腫瘤

2.1 LIMK的表達(dá)與臨床的關(guān)系 目前研究發(fā)現(xiàn)多種分子如研究發(fā)現(xiàn)，LIMK在多種腫瘤如肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌等組織中異常表達(dá)。SU等[17]使用免疫組化檢測(cè)了64例正常胃黏膜及140 例胃癌組織中LIMK1 的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，LIMK1 在胃癌組織中呈高表達(dá)，并且與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、臨床分期及預(yù)后成正相關(guān)。在143例CRC組織中，cofilin、LIMK1、LIMK2、SSH1高表達(dá)，與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期相關(guān)，而化療失敗患者的CRC 組織及耐5-FU 的HT29 細(xì)胞中LIMK1、SSH1 表達(dá)顯著增高，提示LIMK/cofilin 及SSH1 與CRC疾病進(jìn)展及療效相關(guān)[18]；CHEN等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌組織中，LIMK1的表達(dá)顯著高于癌旁組織，并與TMN 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、組織學(xué)類型無(wú)明顯相關(guān)性。MARDILOVICH等[20]對(duì)前列腺癌組織切片進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)LIMK1、LIMK2的高表達(dá)及其底物cofilin磷酸化的增加與非轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的預(yù)后不良和生存期降低具有顯著相關(guān)性，提示LIMK 的表達(dá)及活性與前列腺癌的疾病進(jìn)展相關(guān)。

2.2 LIMK 與腫瘤細(xì)胞功能 肌動(dòng)蛋白具有F-Actin 及G-actin 兩種形式，這兩種形式的動(dòng)態(tài)平衡參與了腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等，LIMK/cofilin通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的重組影響腫瘤細(xì)胞的功能。CHEN等[19]通過(guò)western blot技術(shù)檢測(cè)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中LIMK1的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)在高侵襲性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中LIMK1 的表達(dá)高于低侵襲性細(xì)胞，利用siRNA 下調(diào)801D 細(xì)胞中LIMK1的表達(dá)后p-cofilin表達(dá)下降，細(xì)胞的侵襲、遷移能力減弱，提示LIMK1/cofilin通路與腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力相關(guān)。LI 等[13]通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LIMK1 是miR-138-5p 的靶基因，過(guò)表達(dá)miR-138-5p可抑制LIMK1/cofilin 的表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、HCC1973 的侵襲遷移，并可將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。抑制卵巢癌細(xì)胞中的LIMK1/cofilin 通路也可使卵巢癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力減弱[21]。除了LIMK/cofilin 通路，LIMK 還可通過(guò)其他途徑影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。YOU 等[22]使用LIMK-shRNA 轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細(xì)胞以下調(diào)LIMK1的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LIMK1的表達(dá)后，總FAK、paxillin表達(dá)無(wú)變化，p-FAK、p-paxillin表達(dá)降低，胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力下降，提示LIMK1通過(guò)調(diào)控FAK/paxillin通路調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移能力。

2.3 LIMK與腫瘤耐藥性 腫瘤的多藥耐藥性是腫瘤化療效果不佳的主要障礙，ZHANG 等[23]發(fā)現(xiàn)耐VCR 的骨肉瘤MG63 細(xì)胞中LIMK1、p-cofilin 表達(dá)較正常MG63細(xì)胞高，提示LIMK1可能參與了腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的發(fā)生。為研究LIMK/cofilin與腫瘤細(xì)胞的耐藥性之間的關(guān)系，陳瑞等[24]利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)骨肉瘤MG63 細(xì)胞中LIMK1 的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，LIMK1、MDR1 表達(dá)增加，長(zhǎng)春新堿對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的IC50 值增加，提示LIMK1 表達(dá)上調(diào)與細(xì)胞耐藥性增強(qiáng)有關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，下調(diào)LIMK1可增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌801D細(xì)胞對(duì)順鉑和吉西他濱敏感性[19]，降低順鉑耐藥的A549對(duì)順鉑的耐藥性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。此外，有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)LIMK2在耐微管化療藥物的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，上調(diào)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的LIMK2 可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，下調(diào)LIMK2則可促進(jìn)異常紡錘體形成，導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常，提高耐藥細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿的敏感性[9]。

2.4 LIMK與腫瘤免疫治療 腫瘤免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一，腫瘤的免疫治療也是目前的研究熱點(diǎn)。THAULAND 等[25]對(duì)細(xì)胞骨架狀態(tài)與T 細(xì)胞活化之間的聯(lián)系進(jìn)行了探索，研究發(fā)現(xiàn)原始T 細(xì)胞中F-actin含量低較，細(xì)胞骨架硬度較高，而效應(yīng)T細(xì)胞則相反。當(dāng)APCs 提呈的抗原激活原始T細(xì)胞后可迅速使p-cofilin 去磷酸化，F(xiàn)-actin 增加，T 細(xì)胞骨架硬度降低，免疫突觸增大，從而增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫活性。該研究還發(fā)現(xiàn)RohA-Rock-LIMK-cofilin 通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架硬度影響T 細(xì)胞突觸大小，抑制原始T 細(xì)胞中的Rock、LIMK可使T細(xì)胞免疫突觸增大，增強(qiáng)對(duì)免疫抗原的免疫反應(yīng)。這些研究結(jié)果提示細(xì)胞骨架狀態(tài)與T 細(xì)胞的免疫活性相關(guān)，RohA-Rock-LIMK-cofilin信號(hào)通路可能成為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。

3 LIMK抑制劑

由于LIMK/cofilin 通路參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，許多學(xué)者把它作為一個(gè)腫瘤的治療新靶點(diǎn)，因此一系列的LIMK的抑制劑研究也成為熱點(diǎn)。二烯丙基二硫化物(DADS)是大蒜提取物中的主要活性成分，它可以通過(guò)抑制ROCK1/PAK1/LIMK1/cofilin 信號(hào)通路來(lái)減少大腸癌SW480 細(xì)胞的遷移和侵襲[26]。噻唑基酰胺衍生物BMS-3 和BMS-5(LIMKi 3)可高度抑制LIMK1 和LIMK2，它們可通過(guò)抑制cofilin 磷酸化來(lái)抑制小鼠4T1.2 和人MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞的增殖，并減弱U87 和T98G 多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[27-28]；BMS-3 和BMS-5 可促進(jìn)乙酰化的α-tubulin 表達(dá)，誘導(dǎo)微管異常組裝，從而抑制A549細(xì)胞的增殖[29]。BMS-5 還可通過(guò)干預(yù)雄激素受體與α-tubulin 之間的相互作用，減少雄激素受體核易位和轉(zhuǎn)錄活性從而抑制雄激素受體依賴性前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[30]。MARDILOVICH 等[29]在BMS-5的研究基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了CRT0105446 和CRT0105950，這兩種LIMK抑制劑通過(guò)減少磷酸化cofilin 的表達(dá)而抑制MCF-7 乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)以及MDA-MB-231 細(xì)胞的侵襲性，此外，橫紋肌肉瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤和腎癌細(xì)胞對(duì)這兩種藥物均高度敏感。其他LIMK 抑制劑如Pyr1[31-32]、虎刺醛[33]、葫蘆素I[34]和葫蘆素E[35]、姜黃素[36]均可通過(guò)抑制cofilin 磷酸化從而減弱腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲遷移能力。

除了抗腫瘤作用，LIMK 抑制劑也被應(yīng)用于其他疾病。FEI等[37]設(shè)計(jì)合成的LIMK抑制劑R10015是一個(gè)小分子典型的I 型ATP 競(jìng)爭(zhēng)激酶抑制劑，研究中發(fā)現(xiàn)R10015 可以通過(guò)抑制p-cofilin 從而抑制HIV 以及埃博拉病毒、裂谷熱病毒等其他病毒的逆轉(zhuǎn)錄、核遷移和釋放以及抑制感染的免疫細(xì)胞遷移，從而抑制病毒對(duì)細(xì)胞的感染，表明LIMK 抑制劑可能成為一種新型的廣譜抗病毒藥物。雖然目前已發(fā)現(xiàn)多種LIMK抑制劑，僅有一個(gè)LIMK 抑制劑進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，即LIMK2 抑制劑LX7101[38]，該藥物通過(guò)誘導(dǎo)眼小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的肌動(dòng)蛋白絲解聚使組織松弛，房水流出增加，從而降低眼壓，治療青光眼。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著人們對(duì)腫瘤的不斷探索，當(dāng)下腫瘤的診治水平突飛猛進(jìn)。目前研究已證實(shí)LIMK參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。雖然現(xiàn)在已開(kāi)發(fā)出多種LIMK抑制劑，但其相關(guān)的臨床研究極少，人們還需要進(jìn)一步行體內(nèi)外研究實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)以明確其抗腫瘤的有效性及安全性。總的來(lái)說(shuō)，LIMK 及其潛在的信號(hào)通路可能成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。