表面等離子共振技術研究進展及應用

王永智 葉華躍 聶利芳 吳宏斌 邱文娜 方朝東 雷高新 曾瑋喬

1.泰州醫藥高新技術產業園區疫苗工程中心，江蘇泰州225300；2.江蘇華泰疫苗工程技術研究有限公司，江蘇泰州 225300；3.江蘇大同盟制藥有限公司，江蘇泰州225300

1 表面等離子共振技術的發展歷史及研究進展

1902年R.W.Wood[1]在一次光學實驗中觀察并記錄了金屬光柵的異常衍射現象，他稱之為“Wood異常”，這是人們首次記錄的表面等離子共振（surface plasmon renounce，SPR）現象。1941年U.Fano依據金屬和空氣界面上表面電磁波的激發原理首次成功解釋了SPR現象[2]。Kretschmann于1971年提出Kretschmann結構為SPR生物傳感器奠定了基礎，同時也促成了SPR技術在實驗中的應用[3]。1983年，Liedberg等首次利用SPR進行IgG與其抗原的反應測定并取得了成功。1987年，Knoll等開始進行SPR成像研究，1990年，Biacore AB公司推出了首臺商用SPR儀器，使SPR技術的應用研究得到了更快速的發展[4]。

SPR的原理為當一束單色偏振光透過玻璃照射到鍍在玻璃表面的金或銀薄膜時，自由電子在金屬和玻璃介質表面積聚，產生表面極化電荷。表面電荷的集體震蕩便產生了表面等離子體波（surface plasmon wave，SPW）。產生表面等必須將入射光與表面等離子波通過耦合器件進行耦合，使二者發生共振，當表面等離子波當入射光的波向量與SPW的振蕩頻率相匹配時[5]，便產生了SPR現象。常用的耦合器件主要有棱鏡型[6]、光柵型[7]、光纖型[8-9]、光波導型[10]等，其中商品化的SPR儀器主要采用的是Kretschmann棱鏡結構[10]。SPR發生后，SPW吸收了入射光的能量，反射光的能量則急劇下降以致完全消失，此時入射光的角度被稱作SPR角（共振角）。SPR角隨金屬薄膜附近介質折射率變化而改變化，介質折射率變化情況一般又會受到待測溶液中的物質濃度的變化情況影響。因此通過測量SPR角的變化情況便可以反應待測溶液中的一些產生反應的情況[11-13]。

SPR技術主要的特點有[14-17]：（1）免標記檢測。SPR 技術不需要標記樣品或者對樣品進行衍生化處理便可以檢測。這樣不僅保持了被檢測分子的性質和狀態，而且避免了標記過程對檢測結果的不利影響。同時方便了樣品處理，簡化了檢測流程。（2）實時動態分析。SPR技術可以實時動態監測分子相互作用的全過程，得到反應速率及動力學方程。（3）非破壞性檢測。SPR技術檢測過程不會對樣品造成任何化學或物理破壞。（4）高選擇、高靈敏性。利用生物識別、化學及物理識別等各種高特異性識別作用，需要樣品數量少。（5）應用范圍廣。應用SPR技術檢測分析的對象非常廣泛，既可以研究分子質量很小的物質（如金屬離子、氣體分子），又可以研究相對分子質量達數十萬的生物大分子（如蛋白質）甚至細胞及病毒。

2 SPR技術的應用

2.1 SPR技術在分子生物學檢測領域的應用

生物分子發揮功能與其結構密切相關，生物分子結構的維持取決于生物分子內部集團之間或者分子之間的各種相互作用力。生物分子之間特異地、可逆地識別及結合等相互作用是生命活動的基礎。研究分子間的相互作用是生化領域的一個核心問題，它有助于闡明生物反應的機制，揭示生命現象的本質[13]。SPR技術目前已成為分子生物學領域研究的熱門工具，被廣泛應用于蛋白質、核酸及多糖等生物大分子之間的相互作用研究。

Margulies等[18]利用SPR技術分析了主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）與 抗 原 遞 呈 細 胞（antigen presenting cell，APC）遞呈的抗原（Ag）之間的相互作用、T細胞受體（T cell receptor，TCR）與MHC/Ag之間的相互作用以及TCR與Ag之間相互作用的動力學常數。通過研究發現，TCR與MHC/Ag之間的相互作用具有親和力低、半衰期短的特點，表明通過短暫及低親和力的相互作用即可激活T淋巴細胞。

崔大付等[19]利用SPR技術建立了檢測6-氧甲基鳥嘌吟-DNA甲基轉移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）的方法。MGMT是一種重要的DNA損傷修復酶，與DNA烷基化損傷修復密切相關[20]，對多種腫瘤具有重要的臨床意義[21-26]，MGMT的檢測可以為抗腫瘤藥物的開發、腫瘤的預防及治療方案提供依據。其建立的GMGT檢測方法檢測線可低至1.18×10-10mol/L，為進一步推廣使用及臨床檢測的研究打下了基礎。

李雪玲等[27]利用SPR技術研究比較了抗酪氨酸磷酸化抗體與來源于胰島素樣生長因子Ⅰ受體（insulin-like growth factor 1，IGF-1R）的未磷酸化多肽序列及經過含有相應蛋白激酶的細胞裂解液處理后的多肽序列的相互作用差異。結果表明，抗酪氨酸磷酸化抗體與經細胞裂解液在不同處理條件下（孵育時間不同、細胞裂解液成分不同）處理后的多肽序列相互之間作用存在明顯差異，可靈敏地區分出多肽酪氨酸磷酸化水平差異。胰島素樣生長因子Ⅰ受體（IGF-1R）信號轉導通路與生物體細胞增殖、分化及抑制細胞凋亡等多種生理活動密切相關，其建立的研究方法為受體磷酸化信號通路的研究提供了一種全新的手段。

2.2 SPR技術在環境污染檢測領域的應用

隨著人類社會生產經濟的快速發展，物質和文明水平的不斷提高，環境污染問題也日趨嚴重。如何對環境污染物進行快速、準確的檢測分析也越來越受到人們的重視[28]。選擇及開發適宜的環境污染物檢測技術，有助于提高檢測結果的準確性及科學性，甚至關系到環境污染評價及環境治理措施的制定[29-30]。SPR技術的出現及快速發展，因其具有檢測特異性強、靈敏度高及檢測快速等優點，為環境污染物檢測提供了一種全新的方法，并逐步在環境污染檢測中得到越來越廣泛的應用。

銅是動植物生長必需的微量元素，通常以化合物的形式存在于環境之中[31]。環境中過量的銅則會導致銅在生物體內積累而產生對動植物體產生毒害作用，因此人們對銅造成的環境污染也特別關注[32]。Wenhua Wang等[33]利用改性殼聚糖（MCS）修飾的銀/金（Ag/Au）復合薄膜，研制了一種可重復使用的SPR傳感器，可實現銅離子的快速檢測。該研究采用四層Kretchmann半柱面棱鏡結構，通過引入參比光束，提高了實驗系統的靈敏度和穩定性。經過優化，MCS膜在傳感器芯片沖洗4次后的溶脹速率＜9×10-4/min，在MCS膜經吸附Cu2+及多次沖洗后信號值下降＜1.5%。用0.5mmol/L的EDTA溶液對傳感器進行5次洗脫后，洗脫率和容量率均在96%以上。經實驗表明該方法Cu2+的檢出限低至18ppb。

環境內分泌干擾物（endocrine disrupting chemicals，EDCs）是存在于環境中的能干擾人類或動物內分泌系統的外源性化學物質[34]。內分泌干擾物并不直接作為有毒物質給生物體帶來毒害，而是通過擬激素或抗激素作用導致人類或動物的內分泌紊亂，甚至導致人類和動物生殖系統發育異常、生殖機能失常、神經系統發育延緩、智力損害甚至導致物種滅絕[35]。二噁英、多氯聯苯及諸多農藥均屬于內分泌干擾物。Shimomura等[36]利用SPR技術建立了一種基于競爭性免疫分析手段的快速測定2，3，7，8-四氯二苯并-對-二噁英（2，3，7，8-TCDD）、多氯聯苯（PCB）、除草劑阿特拉津的方法，三者的檢測限分別為0.1、2.5及5ng/mL，并且每個樣品分析時間僅需15min。

2.3 食品安全檢測領域的應用

俞婧等[37]基于SPR技術建立了快速測定豬肉中磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，SM2）殘留的方法，該研究將SM2偶聯到傳感器芯片表面，通過優化檢測條件，結果表明，建立的檢測方法在低（10μg/kg）、（20μg/kg）、高（100μg/kg）三個濃度水平的回收率為87.6%～107.4%。樣品檢測結果經液相色譜-質譜/質譜法確證，表明該方法可用于豬肉中SM2的快速篩查分析。

李輝等[38]利用實驗室自行研制的SPR系統，通過化學偶聯，將萊克多巴胺衍生物固定于芯片表面，基于在一定濃度范圍內的萊克多巴胺抗體與萊克多巴胺結合的響應值呈線性關系的原理，經過檢測條件的優化，采用連續進樣的檢測方法對萊克多巴胺進行定量分析檢測。結果表明，該方法的檢測時間為15min，萊克多巴胺檢測限＜4μg/L，IC50值為8.5μg/L。并且通過觀察結合反應傳感圖，發現萊克多巴胺的抗體與萊克多巴胺之間的結合反應在檢測時間之內遠未達到飽和狀態。因此后期可通過延長反應時間以擴大萊克多巴胺檢測范圍，降低檢測限。

劉瑾等[39]利用SPR技術建立了牛奶中的氨芐青霉素殘留檢測方法，該研究從pH值、離子強度和配體濃度三個方面探討、優化了氨芐青霉素-BSA固定至芯片表面的條件。通過檢測不同濃度的氨芐青霉素水溶液和牛奶溶液，最低檢測限分別達到了1.7ng/mL和1.8ng/mL，兩者均低于歐盟規定的最大檢出限4.1ng/mL，證明了該方法的可行性。

2.4 表面等離子體共振技術在藥物研究中的應用

近年來，全球生物制藥產業發展迅速，新的生物藥分析檢測技術也層出不窮，SPR作為新興的生化分析檢測工具，憑借著其出色的準確性、穩定性和高重復性，在藥物篩選、藥物作用機理研究、藥物評價等方面得到越來越廣泛的應用[13]。

親環素A在許多細胞中發揮蛋白質折疊伴侶及胞內轉運作用，有研究表明親環素A可通過與HIV-1 Gag蛋白相互作用并增強病毒的感染性。親環素A抑制劑如多環菌素A在體外可抑制HIV-1的復制[40]。Chen等[41]通過計算機輔助虛擬篩選及SPR分析技術，選擇了12種小分子化合物作為候選親環素A抑制劑。通過體外研究12種小分子化合物抑制親環素A酰脯氨酸順反異構酶（peptidylprolyl cis-trans isomerase，PPIase）活性，結果發現其中五種化合物（FD5，FD8，FD9，FD10 and FD12）具有抑制PPIase及HIV-1感染的活性。

人血清白蛋白是血漿中最為豐富的蛋白質，占了血漿所有蛋白總量的60%[42]，血清白蛋白能與許多內源及外源性化合物結合，從而起到重要的存儲和轉運作用[43]，藥物進入人體后，與人血清白蛋白在體內可產生不同程度的結合，這種結合對藥效學和藥動力學起著重要的作用[44]。Frostell等[45]將人血清白蛋白固定于芯片表面，利用SPR技術分析了19種藥物與血清白蛋白的結合作用，所得結果與已有報道一致。各藥物以單濃度進樣（80mM），分析各個藥物與血清白蛋白結合作用，依據結合作用的強弱可將藥物分成高、中、低三個組。該研究建立的方法可實現24h內篩選100個化合物，并且樣品消耗量低至8nmol。

在對抗體類生物類似藥與參照藥進行比對研究時，抗體與抗原的親和力是質量評價的一個重要指標。稅雪等[46]利用表面等離子體共振技術比較分析了國產西妥昔單克隆抗體（Cetuximab）及國外已上市的西妥昔單抗Erbitux與重組人表皮生長因子受體（EGFR）的結合能力。結果顯示，C225與Erbitux在與重組人EGFR的結合能力上，有相似的結合動力學特性，為生物類似藥與參照藥比對研究評價提供了依據。

3 SPR技術發展展望

自SPR技術出現以來，特別是自商品化的SPR分析儀投入市場以來，SPR技術就因其具有的獨特優勢在分子生物學研究、環境污染物檢測、食品安全檢測、藥品研發等領域得到了越來越廣泛的應用，SPR技術測定對象也已經覆蓋了從小至金屬離子到大至病毒乃至細胞[47-48]。此外，SPR傳感器及分析儀研發也取得了長足的進步，通過引入新的傳感方法[49]，進行新的結構設計[7]，或在傳統分析儀的基礎上提高儀器的性能和實用性[50]。均有效提高了SPR分析儀的靈敏度和精度。筆者認為SPR技術未來發展的方向除了繼續擴大SPR技術檢測應用領域以外，還要進一步探索加快SPR技術與其他已有技術方法的聯用。Meyer等[51]將SPR技術與表面增強拉曼散射技術（surface-enhanced raman scattering，SERS）結合起來，制作了SPR-SERS聯用儀并驗證了該儀器應用的可行性。其研究成果為SPR技術應用開辟了全新的發展方向。SPR技術與其他技術聯用也日趨廣泛，如SPR技術與質譜技術聯用可將SPR技術的藥物篩選、配體垂釣功能與質譜的結構分析功能進行整合，提高藥物篩選效率；SPR技術與電化學分析技術聯用，有助于大大提高檢測靈敏度，降低檢測限。除此之外，加大新型芯片的開發力度，降低分析物與芯片基質表面的非特異性結合，提高分析的分辨率，開發更適宜小分子分析的芯片也將更加有力促進SPR技術的應用。