兩種菌體前處理方法對MALDI-TOFMS鑒定臨床分離菌效果的影響

楊銘華，闞秀梅，孫喜娟，晏培杰，宋娜

哈爾濱市兒童醫院檢驗科，黑龍江 哈爾濱 150010

1 材料與方法

1.1 材料 菌株來源：由實驗室保存和分離的43種臨床常見菌株。主要試劑和儀器：MALDI-TOFMS微生物樣品處理試劑，384目標板，組分I（包括乙腈，甲酸，純水）6,000 μL，組分II（包括乙腈，三氟乙酸，純水）200 μL哥倫比亞血液板，沙寶弱片[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜系統（Microflex，北京布魯克科技有限公司），生物安全柜（Biobse B2-x），恒溫培養箱（Thermo Fisher 3111），紅外接種環滅菌器（UniPower-I），渦旋混合器（GL-88B），緊湊型離心機（LX-300）。

1.2 方法

1.2.1 菌株傳代 將在哥倫比亞血液平板上收集的革蘭氏陽性細菌（16株）和革蘭氏陰性菌（14株）雜交，并將真菌（13株）用沙寶弱板培養。傳代培養條件：將細菌置于37 ℃，含5%CO2培養箱中18-24小時，并在35 ℃真菌培養箱中制備霉菌24-48小時。

1.2.2 儀器校準 在測試之前，使用單個大腸桿菌ATCC 25922菌落作為儀器校準標準。

1.2.3 提取方法 將20-30 μL組分I加入每個離心管（200 μL）中，從上部菌落中取出單個菌落，并與1 μL無菌接種環或移液管尖端混合。混合并搖動5分鐘后，將1 μL樣品加入到靶板中并使其風干，加入1 μL組分II以覆蓋樣品點并使其風干。每個樣品平行檢測3次[1]。

2 結果

見表1。

3 討論

在這項研究中，43種臨床分離株以兩種不同的方式進行預處理，并通過MALDI-TOFMS進行鑒定。結果表明，MALDI-TOFMS鑒定革蘭氏陽性菌和真菌的準確率明顯高于提取方法后的涂片處理。可以看出，適當的微生物預處理可以改善MALDI-TOFMS鑒定。蛋白質指紋精確度和穩定性以上結果與趙桂明等的結果一致直接應用快速且易于處理，但對其他細菌代謝物更敏感、更容易變化。但是，甲酸-乙腈提取可以從細菌中提取蛋白質。得到的圖中蛋白質離子峰的強度是一致的。但提取方法得到的離子峰的信號峰值相對較高，包括更多蛋白質標記物[2]。有研究[3]使用直接涂抹和提取方法鑒定和驗證了200株肺炎野生菌株。該比率為100%，通過比較細菌肺炎的特征峰，可以鑒定亞種，為鑒定肺炎克雷伯菌提供了一種快速有效的方法。

表1 臨床分離菌的檢測效果

總之，為了檢測更具體的離子峰并提高蛋白質指紋的準確性和可重復性，本研究提出使用提取方法預處理微生物樣品。這樣可以優化工藝步驟，減少樣品損失，建立標準的微生物檢測過程，并提高質譜鑒定的準確性，對未來的檢測工作都具有非凡的意義。