肺炎支原體RNA和DNA檢測在兒童支原體感染診斷中的應用評價

常婭莉 高嶺

肺炎支原體(MP)是介于病毒和細菌之間的原核細胞型微生物[1]。MP主要通過呼吸道的飛沫進行傳播，是引發小兒肺炎、支氣管炎等下呼吸道感染的常見病原菌[2]。MP感染在青少年更容易發生，數據[3]統計顯示30%的呼吸道感染患兒伴有MP感染。MP感染者除了呼吸道感染外，還可能累及其他器官系統，引發腦膜炎、心包炎等其他感染疾病，嚴重影響兒童的身體健康。因此有效檢出MP感染，對于患兒的治療和預后均有重要意義[4]。MP感染檢測的常用方法包括血清學檢測、快速培養法以及核酸檢測法等，但是快速培養法中樣本中的其他病原體會對結果造成干擾，且耗時，操作繁瑣，而血清學檢測時，檢測結果與患者自身的免疫功能和抗體的轉化有一定的相關性，假陰性的概率較高[5]。肺炎支原體DNA實時熒光定量PCR(MP-DNA) 法是臨床應用較多的一種核酸檢測方法，僅需少量DNA片段即能進行擴增檢測，靈敏度佳，但是仍存在一定比例的假陰性、假陽性[6]。肺炎支原體RNA實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(MP-SAT)是一種新型的核酸檢測法，它以活菌中的特異性RNA片段進行擴增檢測，具有操作簡便，靈敏度高的特點，但是在臨床上相關應用研究不多[7]。本次研究對MP的RNA和DNA的檢測在兒童支原體感染診斷中的應用效果進行了評價比較。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年10月至2018年12月我院收治的86例肺炎患兒作為研究對象。其中男47例，女39例。年齡0.3～15歲，平均年齡(6.9±2.3)歲。本次研究已經醫院的醫學倫理委員會批準通過。病例納入標準：經臨床診斷符合獲得性肺炎的相關標準；年齡≤15歲；之前4周內未接受到抗生素治療；患者的家屬均知情同意并簽署同意書。病例排除標準：存在心肝腎等重要臟器功能障礙者；合并有肺結核、哮喘等其他肺部器官疾病者；無法配合完成治療和隨訪者。

1.2 方法 對所有患兒在入院24 h內進行采集咽拭子標本，并分別用MP-SAT進行檢測RNA和MP-DNA法進行檢測DNA。采用美國ABI公司的7500型實時熒光定量PCR儀進行檢測RNA和DNA。其中MP-SAT試劑盒和MP-DNA試劑盒分別由上海仁度生物技術有限公司和中山大學達安基因股份有限公司提供。嚴格按照檢測試劑盒的相關操作說明進行操作，其MP-SAT的判讀標準為：dt值≤35為陽性，dt值≥40為陰性，介于兩者之前的對樣本重新擴增后，以dt值≤35為陽性，dt＞35為陰性。MP-DNA的判讀標準為：ct值＜30為陽性；ct值≥30為陰性。

根據患兒的臨床癥狀、體征以及其他輔助檢查等方式進行綜合診斷，明確患兒MP感染的情況。所有患兒均采用大環內酯抗生素進行治療，對于確診為MP感染的患兒在治療期間的1周、2周以及3周進行重復檢測MP的RNA和DNA。

1.3 觀察指標 以最終綜合診斷的患兒MP感染結果作為診斷金標準，比較MP的RNA和DNA的檢測在兒童支原體感染診斷中的應用效果，計算其診斷的靈敏度、特異度以及準確率。靈敏度＝真陽性人數/(真陽性人數＋假陰性人數)×100%。特異度＝真陰性人數/(真陰性人數＋假陽性人數)×100%。準確性＝(真陽性人數＋真陰性人數)/(真陽性人數＋假陰性人數＋真陰性人數＋假陽性人數)×100%。并統計比較MP感染陽性患兒在治療期間不同時間點的RNA和DNA的檢測的陽性率變化情況。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0統計學軟件進行處理，計量數據采用(±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數數據采用率進行表示，組間比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RNA和DNA檢測在兒童MP感染診斷中的應用效果比較 經最終診斷，86例患兒中MP感染陽性49例，MP感染陰性37例。其中MP-SAT檢測診斷的MP感染陽性者43例，陰性34例；MP-DNA檢測的MP感染陽性者31例，陰性27例(表1)。

表1 RNA和DNA檢測在兒童MP 感染診斷中的應用效果比較(n)

2.2 RNA和DNA檢測在兒童MP感染診斷的診斷效能分析 MP-SAT檢測診斷兒童MP感染的靈敏度、特異度、準確性分別為87.76%、91.89%、89.53%，MP-DNA檢測診斷兒童MP感染的靈敏度、特異度、準確性分別為63.27%、72.97%、67.74%，MP-SAT檢測診斷的靈敏度、特異度、準確性均高于MP-DNA檢測診斷，差異有統計學意義(P＜0.05，表2)。

表2 RNA和DNA檢測在兒童MP 感染診斷的診斷效能分析 單位：%

3 討論

在小兒肺炎的致病菌中，肺炎支原體的所占比例僅次于肺炎鏈球菌，因此肺炎支原體肺炎(MPP)是常見的小兒肺炎類型之一[8]。MPP患兒沒有典型性的臨床癥狀，多數表現為咳嗽、發熱、頭疼等，嚴重的情況下還會引發多系統的肺外感染癥狀。由于MP缺乏細胞壁，因此針對細胞壁合成進行抑制發揮抗菌機制的萬古霉素以及β- 內酰胺類抗生素治療的效果并不理想，需要采用阿奇霉素等大環內酯類抗生素治療，以控制細胞內的蛋白質合成[9]。因此不同的肺炎類型的治療方案不同，需要及時明確診斷MP感染，以便為臨床治療提供參考依據。支原體培養法是MP感染檢測的金標準，但是培養周期長，操作繁雜，不能滿足臨床快速檢測的要求[10]。MP-抗體的血清學檢測存在一定的窗口期，在感染早期約1周內的敏感性較低，且容易受到機體免疫水平影響[11]。核酸檢測也是MP感染檢測的一種方法，其中以MP-DNA法檢測最為常用。MP-DNA法對基因的DNA片段進行擴增和檢測，與常規的血清學檢測相比，靈敏度高[12]。但是DNA片段在進行PCR擴增時，若操作不規范可能造成感染，出現假陽性、假陰性，影響診斷的準確性。SAT是一種新型的核酸檢測技術，SAT以活體中的RNA作為靶目標，采用M-MLV反轉錄酶以及T7RNA多聚酶等進行恒溫的擴增，從而對病原菌RNA進行檢測[13]。SAT技術在結核分枝桿菌、腸道病毒71型等的檢測中均得到了較好的應用效果，其中診斷效能優于血清MP抗體檢測。且RNA只能在病原菌活體中存在，MP細胞死亡后，細胞內的RNA會快速降解，而DNA的降解周期較長，因此應用SAT方法進行MP檢測，還能較好的提示MP感染的治療好轉情況[14]。本次研究對MP的RNA和DNA的檢測在兒童支原體感染診斷中的應用效果進行了評價比較，結果中MP-SAT檢測診斷兒童MP感染的靈敏度、特異度、準確性分別為87.76%、91.89%、89.53%，高于常規的MP-DNA法檢測。結果 與林苗苗等[15]的研究一致，顯示在兒童支原體感染的診斷中，RNA實時檢測相對而言檢測的靈敏度和準確性更高，應用價值良好。

綜上所述，在兒童支原體感染的診斷中，RNA實時檢測相對而言檢測的靈敏度和準確性更高，應用價值良好。