絞股藍中總皂苷含量測定方法

許芳瑞，劉新艷，劉茜, ，楊宇，趙浩安，曹煒

1. 西北大學食品科學與工程學院（西安 710069）；2. 西安西大生命科學與健康研究院有限公司（西安 710069）

絞股藍（Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino）是葫蘆科絞股藍屬的多年生草質藤本植物，又名七葉膽、五葉參、小苦藥等。從絞股藍中分離的絞股藍皂苷被認為是其藥理活性和臨床效應最重要的活性成分之一，因其具有和人參皂苷相同的四環三萜達瑪烷型結構而備受關注，絞股藍也是目前已知的非五加科人參屬植物中唯一含有人參皂苷類成分的植物，其中皂苷XLIX和A是目前已知能夠定量的絞股藍皂苷。研究表明其具有降血脂[1]、抗癌[2]、抗氧化[3]、神經保護[4]等生物活性。隨著絞股藍的各項研究不斷深入，開發利用逐漸廣泛，絞股藍中總皂苷的定量是絞股藍開發利用的關鍵。不同產地、不同品種、不同采收期的絞股藍中總皂苷的含量不同，有關絞股藍的質量標準不夠健全，絞股藍中總皂苷含量測定方法也沒有統一標準，使得絞股藍的質量得不到保障，這嚴重影響絞股藍及其產品的療效。因此，試驗對絞股藍中總皂苷含量的測定方法進行研究，旨在提供一種簡捷、準確、重復性好的絞股藍總皂苷的含量測定方法，為絞股藍開發利用的質量控制提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料與試劑

絞股藍藥材（購自陜西省平利縣）；XAD-2大孔樹脂、D-101大孔樹脂（美國Sigma）；無水乙醇、正丁醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸（均為國產分析純）；人參皂苷Rb1（純度≥98%，批號wkq18020808，四川成都維克奇生物有限公司）。

1.2 儀器與設備（表1）

儀器 設備型號 生產廠家電子分析天平 JM-B5002 余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司小型粉碎機 XT-1000A 永康市紅太陽機電有限公司低速大容量多管離心機 LXJ-Ⅱ 上海安亭科學儀器冷凍干燥機 FD1C50 北京博醫康實驗儀器有限公司超純水制備儀 UPT-1-10T 四川優普超純科技有限公司L5s紫外分光光度計 L5S 北京賽多利斯科儀器有限公司紫外可見分光光度計 722G 上海儀電分析儀器有限公司

1.3 試驗方法

1.3.1 對照品溶液的制備

精密稱定適量人參皂苷Rb1對照品，加甲醇溶解，制成2 mg/mL的對照品溶液備用。

1.3.2 供試品溶液的制備

取絞股藍藥材烘干，粉碎，過0.250 mm孔徑（60目）標準篩。精密稱定1 g絞股藍粉末，置于圓底燒瓶中，加入50 mL 75%乙醇在80 ℃下回流提取2次，每次1 h。冷卻后離心并合并提取液，將提取液采用旋轉蒸發儀真空濃縮至干，殘渣加水定容至100 mL容量瓶。取1 mL上清液，移入裝有大孔吸附樹脂的層析柱，用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，用25 mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液轉移至旋蒸瓶旋干，用5 mL甲醇溶解，過濾即得樣品液。取1 mL轉移至具塞試管，通過氮吹儀揮干，以此作顯色用。

1.3.3 顯色

溶劑揮干后，加入0.4 mL香草醛冰醋酸溶液，轉動試管使殘渣都溶解，加1.6 mL高氯酸，在60 ℃水浴10 min，取出冰浴冷卻3 min，準確加入5 mL冰醋酸，搖勻后，在最大吸收波長處進行比色。

1.3.4 最大吸收波長的確定

將顯色后的對照品和樣品溶液在紫外可見分光光度計在400~800 nm波長范圍內掃描，分別得到標準品與樣品的可見光譜掃描圖樣，確定其最大吸收波長。

1.3.5 線性關系考察

精密量取20，40，60，80，100和120 μL人參皂苷Rb1標準溶液分別置于具塞試管中，在60 ℃氮吹儀揮干，按1.3.3的方法進行測定。以吸光度（A）為縱坐標，人參皂苷Rb1含量（mg）為橫坐標進行回歸計算，建立回歸方程。

1.3.6 精密度試驗

平行精密吸取6份0.1 mL人參皂苷Rb1對照品溶液置具塞試管中，于60 ℃氮吹儀揮干，按1.3.3的方法進行測定吸光度，并計算含量。

1.3.7 穩定性試驗

取樣品溶液分別于顯色后10，20，30，40，50，60，70，80和90 min測定吸光度。

1.3.8 加樣回收率試驗

采用加標回收率法，平行吸取6份絞股藍總皂苷提取液，分別加入樣品總皂苷含量的50%，100%和200%的對照品溶液，各2份，按1.3.2的方法制備，以及按1.3.3的方法測定吸光度，按式（1）計算加標回收率，即以實際測得的樣品中皂苷含量的增加量除以加標量。

1.3.9 重復性試驗

取5份供試樣品，每份精密稱定1 g，按1.3.2的方法制備，按1.3.3的方法進行顯色測定，在同一條件下記錄吸光度并計算樣品中的總皂苷含量。

1.3.10 不同絞股藍樣品中總皂苷含量的測定

取陜西省平利縣不同批次的絞股藍、絞股藍茶，按1.3.2的方法提取純化后，按1.3.3的方法比色，在550 nm波長處測定吸光度，根據所得到的標準曲線計算樣品中絞股藍總皂苷含量。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

根據有紫外吸收的化合物在最大波長處測量組分的吸光系數最大，靈敏度最高，可以準確地反映被測化合物的特征，排除其他具有紫外吸收物質的干擾。因此，為確保試驗結果的準確性，需要確定試驗中絞股藍總皂苷的最大吸收波長。

人參皂苷Rb1對照品溶液的光譜圖如圖1所示。結果顯示，在550 nm波長處有最大吸收，這與齊敏杰[5]的結果相一致。

圖1 人參皂苷Rb1對照品光譜圖

2.2 標準曲線線性范圍

以吸光度（A）為縱坐標，人參皂苷Rb1的含量（mg）為橫坐標作圖。如圖2所示，試驗中測定絞股藍總皂苷含量的回歸方程為y=3.872 3x-0.014，R2= 0.999 2，結果表明，絞股藍總皂苷（以Rb1計）在0.04~0.25 mg范圍內線性關系良好，設計合理。

2.3 大孔吸附樹脂的選擇

大孔吸附樹脂是一種新型的非離子型高分子吸附劑，它能通過物理吸附選擇性地吸附溶液中的有機物，實現分離純化[6]。試驗提取液分別通過D101大孔吸附樹脂和XAD-2大孔吸附樹脂進行純化，采用D101樹脂純化的絞股藍總皂苷含量為22.11 mg/g，XAD-2大孔吸附樹脂純化的絞股藍總皂苷含量為15.52 mg/g，D101大孔吸附樹脂純化絞股藍總皂苷提取率較高。

安如彬等[7]采用比色法，從富集、純化苜蓿總皂苷的工藝參數及吸附量等方面，研究利用D-101大孔吸附樹脂純化苜蓿中的總皂苷工藝，結果表明D-101大孔吸附樹脂具有較大的吸附容量，即使重復使用也可以得到較高的吸附量。這與試驗所得到的結果相一致。

2.4 精密度試驗結果

通過在1 d內連續6次對單一人參皂苷Rb1含量進行測定從而對精密度進行分析。分別對6份平行對照品溶液中的人參皂苷Rb1含量進行測定，結果如表2所示。樣品的吸光度范圍為0.330~0.350，含量范圍為0.127 1~0.133 6 mg。經計算，上述方法的精密度的相對標準偏差（SRSD）為1.85%，表明上述方法重現性良好。

表2 精密度試驗結果

2.5 顯色穩定性試驗結果

樣品溶液顯色后分別在15，30，45，60，75，100，115和130 min后測定吸光度，結果分別為0.344，0.325，0.324，0.321，0.321，0.319，0.316和0.313。由圖3可得，溶液的吸光度基本趨于穩定，但隨著時間的延長吸光度逐漸下降，因此盡量在短時間內完成測定。

圖3 樣品顯色穩定性試驗

2.6 重復性試驗結果

通過比較6份同一絞股藍樣品在同一條件下測得的吸光度分析該測定方法的重復性，其吸光度及含量見表3。吸光度范圍為0.393~0.421，絞股藍樣品總皂苷含量范圍為2.17~2.31 mg。重復性試驗結果的相對標準偏差（SRSD）為2.46%，表明該方法的重復性良好。

表3 重復性試驗結果

2.7 加樣回收率試驗結果

經上述操作后，加樣回收率結果見表4。吸光度范圍為0.557~1.179，含量范圍為0.179 4~0.372 1 mg，該測定方法的相對標準偏差（SRSD）為2.77%，說明該方法加樣回收率高。

表4 樣品回收率結果

2.8 不同絞股藍樣品中總皂苷含量

陜西省平利縣不同批次的絞股藍、絞股藍茶、絞股藍皂苷片中絞股藍總皂苷含量見表5。平利縣絞股藍批次1和絞股藍批次2的總皂苷含量分別為2.09 g/100 g和2.29 g/100 g，絞股藍茶中總皂苷含量為4.45 g/100 g。絞股藍茶中總皂苷含量是絞股藍的2倍左右。

表5 不同樣品中絞股藍總皂苷含量

3 討論

絞股藍中的皂苷多為三萜皂苷，香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸體系或濃硫酸常用作三萜皂苷的顯色劑，且顯色靈敏度高，顯色原理是絞股藍中的皂苷在強酸作用下脫氫，氧化后與香草醛縮合形成共軛結構，形成特征的紫紅色[8]。樣品的前處理過程對于比色法含量測定的準確性有著重要影響，試驗在前人基礎上得到[9]通過75%乙醇熱回流提取絞股藍中的總皂苷，提取率最高，在充分提取的基礎上，并通過大孔吸附樹脂對樣品進行純化，除去糖等水溶性雜質，減少雜質在比色中的干擾，也有研究采用正丁醇法提取純化絞股藍皂苷[10-11]，但步驟繁瑣，而且耗時比較長，且有機試劑對操作者危害較大，通過大孔吸附樹脂純化皂苷提取液，不僅操作簡單，而且能去除大部分雜質，同時通過比較D101和XAD-2樹脂后發現，D101樹脂對純化效果較好。可能原因是D-101型大孔吸附樹脂是聚苯乙烯型非極性共聚體樹脂，適用范圍較為廣泛，對于不帶極性的有機化合物普遍吸附能力較強，特別是對皂苷類的分離，效果尤佳[12]。

4 結論

采用75%乙醇熱回流提取了絞股藍中的總皂苷，通過D-101大孔吸附樹脂對提取液中的總皂苷進行富集純化，采用香草醛-高氯酸法比色體系測定了絞股藍中的總皂苷含量。結果表明，人參皂苷Rb1在550 nm處有最大吸收，在0.04~0.2 mg有良好的線性范圍，相關系數R2=0.999 2，平均加樣回收率為102.65%，相對標準偏差（SRSD）為2.77%（n=6）。采用D-101大孔吸附樹脂提取純化絞股藍皂苷的方法簡單、準確、靈敏度高、重復性好，可用于絞股藍中總皂苷含量的測定。試驗為含有絞股藍總皂苷的制劑分析與含量測定提供了一定的參考價值。